基于DNA纳米自组装技术的循环外泌体PD-L1精准检测新方法研究

The circulating exosomal PD-L1, which can effectively assess the response of tumor patients to PD-1/PD-L1 inhibitors, is a potential and significant biomarker for predicting the efficacy of tumor immunotherapy. However, the analytical techniques for circulating exosomal PD-L1 detection are not satisfied to clinical applications. Thus, it is of great significance to develop sensitive and convenient methods for the precise detection of exosomal PD-L1. Based on our preliminary studies on sensing applications of DNA nanotechnology, in this project, specific target recognition, signal amplification and signal readout will be organically integrated on chemiluminescent biosensing platform, and a novel dendritic DNA nanoassembly system will be constructed. So, a simple and rapid analysis strategy for the detection of circulating exosomal PD-L1 will be proposed. Then, allosteric DNA toehold regulation mode will be introduced into dendritic DNA nanoassembly system with the cooperation mechanism of multi-step reactions being studied, and an innovative enzyme-free and label-free circulating exosomal PD-L1 analysis technology will be established with high specificity and excellent sensitivity. Finally, with matrix effect being studied, the founded methods will be applied to precisely detect circulating exosomal PD-L1 in clinical specimens. This project will present a powerful platform for accurate evaluation of the patients benefiting from PD-1/PD-L1 inhibitors and implementation of individualized tumor immunotherapy.

循环外泌体PD-L1能够有效评估肿瘤患者对PD-1/PD-L1抑制剂的反应性，是预测肿瘤免疫治疗效果的潜在新型标志物。目前外泌体PD-L1的检测方法尚无法满足临床需求，因此，研究灵敏便捷的外泌体PD-L1精准检测新方法具有重要意义。基于课题组在DNA纳米技术传感应用的研究基础，本项目拟在化学发光传感平台上有机整合特异性靶向识别、信号放大和信号检测，构建新型树枝状DNA纳米自组装体系，发展简单、快速的循环外泌体PD-L1检测新策略；再将变构DNA teohold调节模式引入树枝状DNA纳米自组装体系，并探索共反应体系中多步反应的协同机制，建立高特异、高灵敏的一体化循环外泌体PD-L1的无酶、免标记的检测新方法；最后，探讨复杂基质对传感检测的影响，实现临床生物样本中外泌体PD-L1精准检测。本项目的实施将为PD-1/PD-L1抑制剂获益患者的精准分层和个体化肿瘤免疫治疗提供有力的技术支持。

循环外泌体PD-L1能够有效评估肿瘤患者对PD-1/PD-L1抑制剂的反应性，是预测肿瘤免疫治疗效果的潜在新型标志物。然而，外泌体体积小、具有自由漂浮的特征，并且每个外泌体携带的蛋白质数量少，限制了对外泌体PD-L1的准确分析。因此，发展灵敏便捷的外泌体PD-L1检测新方法具有重要意义。基于课题组在DNA纳米技术传感应用的研究基础，本项目构建了适体激活级联引物交换反应（PER）的高灵敏一步检测方法，实现对外泌体PD-L1的定量和可视化检测。首先，适体探针特异性识别外泌体PD-L1，并发生构象改变，暴露引物1。随后，引物1激活级联PER，生成包含大量G-四链体的分枝状DNA纳米结构，结合硫黄素T（ThT）染料，从而产生放大的荧光信号。该方法具有两个显著优势：第一，级联PER可显著增强信号，实现对低水平外泌体PD-L1的准确定量；第二，在外泌体表面直接生成分枝状DNA纳米结构，可扩大单个外泌体的尺寸，并限制外泌体的运动速率，在无需任何荧光标记和分离步骤的条件下，即可实现外泌体PD-L1成像。利用新方法检测不同浓度的外泌体，在1×103~1×109 particles/mL范围内，荧光强度与之呈线性关系，最低检测限为1.70×102 particles/mL，证实该方法具有良好的灵敏度。运用新方法分析PD-L1阳性肿瘤细胞（MDA-MB-231，A549，MCF-7），正常细胞（L02）和PD-L1阴性细胞（K562）来源的外泌体PD-L1水平，发现MDA-MB-231＞A549＞MCF-7＞L02，并且PD-L1阳性细胞组的外泌体PD-L1水平明显高于PD-L1阴性细胞组，证实构建的新方法可区分多种细胞来源的不同水平外泌体PD-L1。利用新方法分别检测NSCLC患者组和健康对照组的循环外泌体PD-L1，NSCLC患者组的外泌体PD-L1水平明显高于健康对照组（P<0.0001）。此外，外泌体PD-L1浓度的ROC曲线下面积为0.99，证实新方法具有较好的准确度，有望应用于临床样本分析。因此，本项目发展的新方法为PD-1/PD-L1抑制剂获益患者的精准分层和个体化肿瘤免疫治疗提供了有力的技术支持。

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