剧毒鹅膏“毒素基因岛”及毒素合成关键基因功能研究

Worldwide mushroom poisonings by accidental consumption occur every year, and in most cases the causal agents are lethal Amanita species. The toxins in these mushrooms are Amanita cyclic peptides. They are biosynthesized on ribosomes through a rare combinatorial mechanism. The cyclic peptide biosynthetic genes co-localize at a specific genomic locus in Amanita, but, unlike classic gene clusters, a large number of irrelevant genes intersperse with the biosynthetic genes. We temporarily named this gene arrangement “genomic toxin island”, and its structure and functions of the genes within need to be investigated. This study intends to take advantages of 6 lethal mushroom genomes, including those previous obtained and the ones currently under sequencing. This proposed project aims to obtain a detailed map of the “genomic toxin island” of a lethal Amanita, A. subjunquillea, and to close gaps in the locus using various experimental methods. Furthermore, our study will functionally analyze one or two key cyclic peptide biosynthetic genes through heterologous expression to establish their molecular mechanisms and roles in the biosynthetic pathway. This research is of great scientific merit by providing deep insights into the framework of Amanita cyclic peptide biosynthetic metabolic pathway, and into the functions of the key genes. It also has practical value as gene specific sequences for the cyclic peptide biosynthesis can be applied for detecting lethal Amanita mushrooms, and for preventing the poisonings they cause.

世界上每年都有人误食毒蘑菇而中毒死亡，其中多为剧毒鹅膏所致。剧毒鹅膏中的毒素为鹅膏环肽。已有研究表明，鹅膏环肽生源合成是通过核糖体采用十分罕见的“组合式机制”实现的。鹅膏环肽合成基因聚集在基因组特定位点，但与一般的基因簇不同，在限定区域内，环肽合成基因与大量无关基因交互分布，故暂称为“毒素基因岛”，其结构和基因功能有待研究。本研究拟利用前期获得的和正在测序的共6种剧毒蘑菇基因组，对黄盖鹅膏基因组中“毒素基因岛”的序列缺口通过实验手段进行填补以获得精细图，在此基础上对其组成和结构进行深入研究，综合分析确定1−2个环肽毒素合成关键基因，通过异源表达和生化方法解析其功能，阐明分子催化的具体机制，确定其在鹅膏环肽合成途径中的作用和地位。本研究对深入认识剧毒鹅膏环肽生源合成途径的整体框架及阐明关键基因的功能具有重要的科学意义，对利用环肽合成基因特异性序列来指导剧毒鹅膏检测及中毒预防有特殊实践价值。

误食有毒蘑菇引起的中毒事件已成为我国最主要的公共卫生问题之一；历年来，我国鹅膏环肽毒素致死案例约占总数的68-91%。本项目聚焦剧毒鹅膏及含鹅膏环肽毒素的重要蘑菇物种，阐明了剧毒鹅膏环肽生源合成代谢途径的总体框架，功能解析了2个毒素合成关键基因，揭示了该途径的水平基因转移本质。项目通过新一代测序技术结合BAC基因组文库获得了黄盖鹅膏染色体级的基因组精细图。项目主体研究基于团队前期获得的剧毒鹅膏基因平台（包含13个含鹅膏环肽蘑菇基因组精细图），通过遗传学和比较基因组研究，不仅对剧毒鹅膏环肽合成途径的总体框架结构有了清晰的认识，还精确描绘了盔孢伞中的环肽合成基因簇，并对环柄菇中代谢途径情况有了初步的认识。本项目新发现至少6个新毒素合成候选基因，通过异源表达和基因敲除的方式验证了2个剧毒鹅膏环肽合成新基因（FMO1和P450-29），二者为不同类型的加氧酶。FMO1的缺失导致鹅膏环肽完全不能合成且中间产物缺失1-3个氧原子，P450-29的缺失导致2个关键羟基不能形成，产物活性降低1000倍。遗传距离和比较基因组研究表明鹅膏环肽生源合成途径来自水平基因转移且发生年代久远，不同属中该途径已经发生明显分化，既有基因簇也有分散分布模式，剧毒鹅膏介于二者之间具有部分“基因岛”的特征，毒素基因的扩张情况也迥异。综上，本研究围绕本领域关键的核心科学问题展开了系统研究，产出了多项关于鹅膏环肽生物合成的新发现，从深入认识剧毒鹅膏环肽生源合成途径的整体框架结构，到阐明关键基因的功能以及代谢途径的起源进化均进行了深入研究，是剧毒鹅膏乃至真菌毒素生源合成研究中最为基础性的工作。本研究所获得的染色体级基因组和环肽合成基因特异性序列对于指导剧毒鹅膏检测及中毒预防有特殊实践价值，在此基础上本项目完成了首个剧毒蘑菇快速检测试剂盒的研制工作，形成了相关实用产品，可在3-5分钟内完成鹅膏环肽毒素的检测。

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