Ang-2/Tie2-CREB-STAT5信号通路在组织工程骨早期血管化过程中的作用机制研究

Seeded mesenchymal stem cells (MSC) can accelerate the vascularization of tissue-engineered bones (TEB). Studies on the elusive functional mechanisms will help to promote the popularization and application of TEB. Previous findings have demonstrated that implanted MSC aid vascularization via recruiting host monocytes/macrophage cells (Mp). Thereinto, angiopoietin-2 (Ang-2) released by Mp, triggered by MSC, plays a critical role. Recent literature have indicated that Ang-2 can induce the expression of VEGFR2 of endothelial cells (EC). However, the mechanism remains unclear. Via preliminary experiments, we have screened the transcription factors upstream of VEGFR2 and found that STAT5 might be a pivotal regulator. Moreover, previous studies have identified that cAMP-response element binding protein (CREB) can bind to the promoter of STAT5. Thus, we here speculate that implanted MSC recruit host Mp and allow them to release abundant Ang-2, which activates the Tie2 receptor and downstream CREB-STAT5 signaling pathway of EC and upregulates VEGFR2 expression, to promote the vascularization of TEB. For verification, we will use special techniques, such as RNA interference, to illuminate the significance of CREB and STAT5 in the Ang-2-VEGFR2 regulation process. Then, further confirmation will be achieved based on the signaling pathway inhibition assays in vivo. This study will investigate the pro-angiogenic mechanism of MSC and provide theoretical basis for the improvement of TEB.

间充质干细胞（MSC）可促进组织工程骨（TEB）血管化，对其机制的探究有助于TEB推广应用。研究表明，MSC通过募集宿主单核/巨噬细胞（Mp）促进TEB血管化，MSC调节Mp释放的血管生成素2（Ang-2）在其中发挥关键作用。新近研究提示Ang-2可诱导内皮细胞（EC）表达VEGFR2，但机制不明。经预实验对VEGFR2上游转录因子筛选发现STAT5可能是重要调控因子，而环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）可与STAT5启动子结合。据此推测MSC募集Mp并使其释放Ang-2通过Tie2受体激活EC内CREB-STAT5通路，上调VEGFR2表达，从而促进TEB早期血管化。为证实该假说，拟在体外利用RNA干扰等技术阐明CREB及STAT5在Ang-2调节VEGFR2表达过程中的重要作用；并在体内采用信号通路抑制等手段加以验证。本研究将探索MSC促血管化机制，为改善TEB效能提供理论基础。

本课题探讨了组织工程骨（TEB）移植后种子细胞MSC促进其早期血管化的作用机制，旨在证实“MSC募集宿主单核巨噬细胞Mp，促使其释放Ang-2，通过激活Tie2-CREB-STAT5信号通路促进内皮细胞EC的VEGFR2表达，从而诱导早期血管生成”的假说，为阐明TEB的血管化机制提供理论依据。本课题进展顺利，按照计划完成了大部分的实验内容。首先，在体外实验中基于基因干预，观察并评价了Ang-2、Tie-2、CREB对EC的增殖、迁移和血管生成能力的影响，利用RT-PCR和WB检测了信号分子在EC迁移过程中的重要作用，通过Co-IP探索了CREB的互作蛋白，证实了Ang-2通过Tie2-CREB-STAT5对VEGFR2的影响作用及相关机制。进而，培育了条件基因敲除小鼠，构建了TEB并植入改良的小鼠股骨双侧临界骨缺损模型，利用信号通路抑制剂等手段施加干预，术后通过IF共定位分析、分子生物学、影像学等手段观察了H型EC迁移及其内信号分子表达变化，明确了CREB、STAT5在Ang-2调节VEGFR2表达及H型EC迁移过程中的关键作用，对体外实验的结论进行了进一步验证。其次，完成了动物实验的血管化和成骨功能评价，最终证实MSC募集宿主Mp后，Mp释放的大量Ang-2，通过Tie-2-CREB-STAT5信号通路调节TEB内部血管生成和成骨修复。最后，在探索Ang-2作用机制的过程中，发现对于H型EC而言，除了假说中提出的 Ang-2/Tie-2-CREB调节通路外，Ang-2的促血管生成作用可能存在其他途径；进一步的研究提示不依赖于Tie-2的活化，GSK3β-CBP或GSK3β-ZEB1作为Ang-2的下游信使具有潜在的研究价值。通过本课题研究，明确了TEB移植后MSC募集并促使宿主Mp分泌大量的Ang-2，通过调节EC的VEGFR2表达从而促进早期血管生成的作用方式及机理。研究结果一方面加深了对此领域的认识，另一方面，研究过程中的重要发现为进一步深入阐明TEB的成骨及血管化机制提供了研究思路，也为高诱导活性骨组织工程产品的研发提供了实验基础。

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