黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶对无乳链球菌的抑杀作用机制研究

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    41706177
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    24.0万
  • 负责人：
    黎睿君
  • 依托单位：
    大连海洋大学
  • 学科分类：
    D0604.生物海洋学与海洋生物资源
  • 结题年份：
    2020
  • 批准年份：
    2017
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2018-01-01 至2020-12-31

项目摘要

In our previous study, we isolated a significant antimicrobial L-amino acid oxidase (named SR-LAAO) from the serum of Siganus oramin. The results of antimicrobial spectrum showed that SR-LAAO had a strong inhibitory effect on important pathogens, Streptococcus agalactiae. But the antibacterial mechanism of SR-LAAO to S. agalactiae was unknown. In this project, the dynamic process of SR-LAAO killing S. agalactiae was observed by electron microscopy imaging. Through reactive oxygen species (ROS) measured, monoclonal antibody binding inhibition and protein FITC labeled imaging method, to reveal whether SR-LAAO could selective bind the surface of S. agalactiae and partially produce high concentrations of ROS, or directly produce high levels ROS in the environment to kill bacteria; By comparison transcriptome analyses, to analyze the different antimicrobial molecular mechanisms between SR-LAAO and ROS; Using N-glucosidase hydrolysis experiments and point mutagenesis techniques, to elucidate whether glycosylation had played an important role in the anti- S. agalactiae activity of SR-LAAO. All in all, this project will further reveal the antimicrobial mechanism of SR-LAAO, and provide theoretical basis for developing new potential antibacterial agent.
在前期的研究中，我们从黄斑蓝子鱼血清中分离到了具有显著抗微生物活性蛋白—黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶（SR-LAAO）。其抗菌谱表明，SR-LAAO对重要病原—无乳链球菌具有强烈的抑杀作用。关于SR-LAAO对无乳链球菌抑杀作用机制未知。本项目通过电子显微成像，揭开SR-LAAO对无乳链球菌细胞毒性的动态过程；采用活性氧（ROS）定量、ROS水解剂抑制、单克隆抗体拮抗、FITC标记成像，解答SR-LAAO是通过与无乳链球菌细胞表面选择性结合，局部产生高浓度ROS抑杀细菌，还是直接通过产生高浓度的ROS抑杀细菌；利用差异转录表达谱，比较分析SR-LAAO与ROS分别抑杀无乳链球菌的分子机制差异；通过N-糖酰胺酶水解实验，以及点突变技术，明确糖基化在SR-LAAO抑杀无乳链球菌过程中发挥的作用。本项目的开展有助于进一步揭开SR-LAAO的抗菌机制，为开发新型绿色抗菌药物提供理论基础。

结项摘要

在前期的研究中，我们从黄斑蓝子鱼血清中分离到了具有显著抗微生物活性蛋白—黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶（SR-LAAO），其抗菌谱表明，SR-LAAO对重要病原—无乳链球菌具有强烈的抑杀作用，但关于SR-LAAO对无乳链球菌抑杀作用机制未知。本项目根据昆虫细胞密码子的偏嗜性对黄斑蓝子鱼SR-LAAO的基因序列进行优化合成，构建和优化了SR-LAAO体外重组表达体系，获得了SR-LAAO重组蛋白，开展了重组表达产物的抑菌效果及酶学特性进行评价，观察了重组SR-LAAO对无乳链球菌细胞毒性的动态过程，分析ROS在SR-LAAO对无乳链球菌抗菌活性中发挥的作用，比较了SR-LAAO和H2O2 抑杀S. agalactiae代谢机制的差异。实验结果表明，按照昆虫细胞密码子的偏嗜性优化后的SR-LAAO可在昆虫Sf9细胞中显著表达，SR-LAAO重组蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌活性，其中分别对无乳链球菌和副溶血弧菌的抑菌效果最强，SR-LAAO对无乳链球菌的抑菌作用依赖于ROS的产生；但细胞毒性的动态过程观察结果表明H2O2和SR-LAAO对无乳链球菌的抑杀机过程存在显著不同；非靶向差异代谢组学分析结果显示研究，H2O2处理组与SR-LAAO处理组相比，具有差异显著差异的阳离子代谢产物有129个，阴离子代谢物有104个，分别富集到20个代谢通路，在L-氨基酸差异代谢物的分析中，H2O2处理组与LAAO处理组相比，L-麦角硫氨酸（L-Ergothioneine）极显著上调表达，结果暗示SR-LAAO的处理可能显著分解了L-Ergothioneine或者抑制了无乳链球菌该氨基酸的合成，SR-LAAO对无乳链球的抑菌活性可能受到L-麦角硫氨酸的间接调控。本项目结果为进一步开发新型鱼类抗微生物制剂提供了基础，同时为鱼类LAAO的广泛开发应用提供了最直接的参考。

项目成果

期刊论文数量（2）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（1）
Immune defense enzymes: Advances in L-amino acid oxidase of marine animals
免疫防御酶：海洋动物L-氨基酸氧化酶的研究进展
  • DOI：
    10.1111/are.13698
  • 发表时间：
    2018
  • 期刊：
    Aquaculture Research
  • 影响因子：
    2
  • 作者：
    黎睿君;侯玉林;高延奇;金士博;李安兴
  • 通讯作者：
    李安兴
Recombinant expression and functional analysis of antimicrobial Siganus oramin L-amino acid oxidase using the Bac-to-Bac baculovirus expression system
使用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统对抗菌 Siganus oramin L-氨基酸氧化酶进行重组表达和功能分析
  • DOI：
    10.1016/j.fsi.2019.11.062
  • 发表时间：
    2020-03-01
  • 期刊：
    FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY
  • 影响因子：
    4.7
  • 作者：
    Han, Xiao;Huang, Yuxi;Li, Ruijun
  • 通讯作者：
    Li, Ruijun

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其他文献

黄斑蓝子鱼皮肤黏液对刺激隐核虫及一些病原菌的抑杀作用
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    水生生物学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    黎睿君;刘芳;王方华;李安兴
  • 通讯作者：
    李安兴

其他文献

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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