血小板源性生长因子受体-β在脑缺血后血脑屏障修复中的作用机制研究

National clinical guidelines for management of acute ischemic stroke in 2010 covers early restoration of blood flow in ischemic penumbra, restoration of blood-brain barrier (BBB) integrity and treatment of brain edema. Recently, using Cre-loxp system, we investigated the role of platelet-derived growth factor receptor-β (PDGFR-β) in tissue responses and functional recovery after focal cerebral ischemia in the three following mutant mice: postnatally-induced systemic PDGFR-β knockout mice, neural tissue specific PDGFR-β knockout mice, and PDGFR-βfoxedl/foxed mice used as controls. We have demonstrated the crucial roles of PDGFR-β signaling in the BBB restoration by inducing pericyte/vascular smooth muscle cells recruitment, migration and proliferation after cerebral ischemia (Shen et al, J Cereb Blood Flow Metab, 2012). However, the underlying mechanisms of PDGFR-β signaling in pericyte-induced BBB restoration after cerebral ischemia are far from being fully understood. In this study, we further investigated the role of PDGFR-β signaling in experimentally-induced reperfusion ischemic stroke in vivo and the BBB model in vitro in hypoxia condition, using PDGFR-β antagonist and PDGFR-β siRNA, respectively. The principal analysis include the permeability of BBB (including absolute brain water content, Evans blue extravasations and intracerebral hemorrhage), neurobehavioral evaluation, morphologic and morphometrical analyses of tight junction molecules, and ultrastructural analysis of the BBB. To the best of our knowledge, this study is firstly concerned with the role PDGFR-β signal in the BBB restoration by regulating pericyte-induced expression of tight junction proteins in newly-formed blood vessels after cerebral ischemia. Our study will be expected to provide a novel and basic evidence for the prevention, treatment and prognosis of bran edema following ischemic stroke in the clinical practice.

尽早恢复脑缺血半暗带的血液供应，恢复血脑屏障的完整性，防治继发性脑水肿是目前我国急性缺血性脑卒中诊治指南的核心原则。近年，本科研小组自行研制开发了血小板源性生长因子受体-β（PDGFR-β）的系统性以及神经组织特异性基因敲除小鼠，并分别通过大脑中动脉阻塞法建立局灶型脑缺血模型。研究证实PDGFR-β信号的活化有利于脑缺血后内源性的组织修复，神经保护以及机体的功能恢复。然而，这种潜在的保护机制还尚未明确。本项目利用线拴法建立脑缺血再灌注模型及体外血脑屏障模型，在缺血缺氧条件下，分别通过PDGFR-β拮抗剂以及PDGFR-β siRNA特异性阻断血管周细胞的PDGFR-β信号，分析血脑屏障通透性、紧密连接和超微结构的变化、脑水肿的形成及对功能恢复的影响。该项目首次系统的研究PDGFR-β信号系统在脑缺血后血脑屏障修复中的作用机制，可为血管源性脑水肿的临床防治提供有价值的临床依据。

积极恢复血脑屏障（BBB）完整性已成为目前缺血性脑卒中诱发血管源性脑水肿防治的研究热点。我们利用Cre/LoxP系统建立PDGFR-β条件性系统性基因敲除小鼠（Esr-KO），对6月龄Esr-KO小鼠利用光化学法制作大脑中动脉栓塞脑缺血模型。研究发现脑缺血后 Esr-KO组缺血半暗带中血管周细胞的募集、游走和增殖明显减少，新生血管渗透性增加（申杰，中国脑血管病杂志，2016），脑水肿增加，躯体感觉和运动功能恢复差，内皮细胞跨细胞转运增加，紧密连接（TJ）超微结构改变，TJ蛋白表达下降。同时，利用siRNA敲减技术特异性抑制BBB体外缺氧模型中周细胞PDGFR-β的表达；研究发现PDGFR-β siRNA可明显增加BBB通透性。证实缺血血氧后，PDGFR-β信号通路对于维持BBB完整性与神经功能的损伤修复有重要作用（数据未发表）。.近期研究结果也显示：1）脑缺血后 Esr-KO组中TGFβ蛋白表达量明显下降，且与脑水肿的含量有相关性；2）外源性的TGFβ1可部分减少PDGFR-β siRNA诱导的共培养模型对于14C-蔗糖的渗透性；反之，TGFβR1拮抗剂抑制可增加其渗透性；3）外源性PDGF-BB可明显增加周细胞p-Smad2/3蛋白的表达，而PDGF-BB抗体部分抑制其Smad2/3的磷酸化（数据未发表），再结合我们的前期体外BBB模型研究结果，因此，我们推测PDGFR-β和TGF-βR1可能通过对Smad2/3通路的协同调控，经过周细胞的整合作用，共同调节目的基因的表达，调控周细胞分化及血管覆盖，维持BBB功能。通过本项目的研究，为BBB损伤修复的病理机制提出新见解，为该类疾病的防治提供新的分子靶点，为新药研究奠定了理论基础。.我们亦利用Cre/LoxP系统建立神经干细胞PDGFR-β基因敲除小鼠（PDGFR-β-/-），对PDGFR-β-/-神经干细胞（NSCs）进行原代培养。结果显示PDGFR-β-/- NSCs干细胞活性，如第二代神经球的数目、直径、细胞增殖、细胞生存率等指标均明显减少，神经元分化能力明显降低；证明PDGFR-β信号系统在NCSs自我更新、增殖、多向分化方面起重要作用。因此，激活神经干细胞中PDGFR-β信号途径，可能成为今后神经系统疾病细胞替代疗法又一新的治疗策略（申杰，中华细胞与干细胞杂志，2015；申杰，中华神经科杂志，2015）。

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