染色质重塑因子Fun30/Fft3与核小体复合物的结构生物学研究

By sliding or moving the histone octamer to a new position, or displacing the octamer component，chromatin remodelers participate in the regulation of DNA replication, transcription，recombination and DNA-damage response. The core element of chromatin remodelers are helicase-like ATP-hydrolyzing machines that consist of the Snf2 helicase family. Snf2 family can be identified into 24 distinct subfamilies accroding to the multiple sequence alignment of the ATPase-related regions. Yeast Fun30/Fft3 belong to the Etl1 subfamily. Fun30/Fft3 plays important role in DNA double-strand breaks repair, maintain heterochromatin structure and centromeric stability. However, it is poorly understood how Fun30/Fft3 plays role in nucleosome targeting mechanism, regulation, and specialization for particular biological processes. This application will combine X-ray crystallography，Single-particle cryo-electron microscopy with biochemical methods and cell biology to investigate structure, assembly and working mechanism of the Fun30/Fft3-Nucleosome complex.

染色质重塑因子通过改变核小体组蛋白的位置、组分来影响染色质的结构进而调节DNA的复制、转录、重组以及损伤修复。染色质重塑因子的核心成分是一类属于Snf2家族的依赖ATP水解提供能量的解旋酶。依据ATP酶相关序列的同源性，Snf2家族蛋白可分为24个亚家族，酵母Fun30/Fft3属于Etl1亚家族。Fun30/Fft3在DNA双链断裂修复、异染色质结构的维持及中心粒结构的维持方面发挥着重要的作用。然而Fun30/Fft3是如何识别染色质核小体而发挥作用的结构基础仍然不是很清楚。本项目申请拟重点以X-射线晶体学和冷冻电镜单颗粒技术作为主要研究手段，配合生物化学、分子生物学与细胞生物学等方法，系统地开展Fun30/Fft3与核小体复合物的结构与功能研究。

染色质重塑因子利用ATP水解提供的能量来改变核小体组蛋白的位置和组分并引起影响染色质结构的变化，这一变化进而调节DNA的复制、转录、重组以及损伤修复。染色质重塑因子的核心成分是一类属于Snf2超家族的DNA解旋酶。Fun30/Fft3在DNA双链断裂修复、异染色质结构的维持及中心粒结构的维持方面发挥着重要的作用。我们以X-射线晶体学和冷冻电镜单颗粒技术作为主要研究手段，开展了Fun30/Fft3与核小体复合物结构与功能的研究。我们利用X射线晶体学的方法解析了Fft3 N端结构域（222-622aa）2.25Å和Fft3 C端结构域（623-910aa）4.20Å分辨率的2个晶体结构，并证实无论是DNA还是核小体均可激发Fft3（222-910aa）的ATP水解活性。我们还利用冷冻电镜单颗粒技术解析了Fft3（622-910aa）与167bp核小体复合物两类不同结合方式的电镜结构，分析显示Fft3分别结合在核小体SHL+2处（总体分辨率4.39Å）和SHL+3处（总体分辨率5.41Å），将已经解析的晶体结构和上述电镜密度进行了叠合构建了两类复合物的原子模型，发现第一类通过组蛋白H4的N端tail介导，而第二类则通过H2b的N端tail介导，揭示了Fft3发挥功能两种可能的中间状态。其中，染色质重塑因子结合在核小体SHL+3处为首次发现。我们验证了Fft3对核小体的重塑功能，发现在Fft3在不损失ATP水解活性的情况下，使核小体发生滑动的能力很弱，推测可能的原因是Fft3带有很强的正电荷（尤其是helix motif）从而导致Fft3与核小体的亲和力太高。总之，Fft3与核小体复合物结构的解析为我们认识Fft3重塑染色质的功能提供了可靠的结构基础。

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