产气荚膜梭菌β2毒素致病机理的研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31360609
项目类别：
地区科学基金项目
资助金额：
52.0万
负责人：
曾瑾
依托单位：
宁夏大学
学科分类：
C1803.兽医细菌及其他微生物学
结题年份：
2017
批准年份：
2013
项目状态：
已结题
起止时间：
2014-01-01 至2017-12-31

项目参与者：
谢琴；吴晓玲；周晶；马臣杰；包少文；马彦；
关键词：
β2毒素细胞毒性细胞凋亡产气荚膜梭菌致病机理

项目摘要

Clostridium perfringens is an important agent of both enteric and histotoxic infections in humans and domestic animals. These bacteria produce several protein toxins which play key roles in the pathogenesis of diseases. β2 toxin is an important one, which was characterized recently, and its pathogenic mechanism remains largely unknown. In this application, we proposed to explore the potential mechanism of the pathogenic of β2 toxin by evaluating its capacity to induce cell apoptosis and the productions of inflammation-related cytokines and signaling in vitro and in vivo. The functional procedure of the toxin to target cells will also be investigated by co-localizing the toxin and cell membrane or vesicles, and the pathogenesis of the toxin will be performed in mouse model by determining the apoptosis cells and pathogenesis and injury in varied organs. The aims of this study will lay a foundation for understanding the mechanism of pathogenesis, as well as preventing the enterotoxemic disease cause by the infection of Clostridium perfringens.

产气荚膜梭菌是引起动物坏死性肠炎、肠毒血症的主要病原菌之一。该菌主要致病因子是菌体产生的外毒素。β2毒素是其中一种主要的致死性外毒素。目前，对于其致病机理还不清楚。本项目拟在细胞水平研究β2毒素诱导靶细胞株中炎症相关细胞因子及信号通路中调控因子的变化，揭示β2毒素诱导宿主细胞株损伤的可能机制；在机体内外对β2毒素作用于靶细胞及可能引起的细胞凋亡进行研究；在对β2毒素对小鼠毒性作用的临床症状、组织病理学变化以及肝脏氧化损伤等进行分析的同时，对β2毒素在体内的组织嗜性进行组织学及细胞学定位。在综合上述机体内外研究结果的基础上，对β2毒素在体内外的生物学毒性作用进行综合评价和分析，进而揭示由于β2毒素对宿主细胞的损伤而引发动物肠炎产生的可能致病机制，为进一步开展产气荚膜梭菌的致病机理和免疫预防提供理论依据。

结项摘要

产气荚膜梭菌是引起人及家畜出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌，菌体产生的多种外毒素在产气荚膜梭菌致病性中扮演了重要角色，Beta2毒素(CPB2)即为其中一种主要的致死性毒素。目前，关于Beta2毒素细胞毒性和致病机理的研究，国内外报道均很少。本项目主要取得了以下研究结果：1.利用基因重组技术构建、筛选获得BL21 (pTIG-cpb2)重组大肠杆菌，实现了Beta2重组毒素的大量表达，并利用AKTA纯化系统获得纯化的重组Beta2毒素(rCPB2)；结果表明，重组Beta2毒素具有与天然毒素相似的生物学毒性，其ID50为15μg/mL。2.通过杂交瘤细胞融合技术建立并筛选获得三株针对产气荚膜梭菌Beta2毒素的杂交瘤细胞系，经检测确定三种单克隆抗体(McAb)均能通过免疫印迹、ELISA、免疫荧光染色实验和毒素中和实验识别重组的rCPB2。其中，McAb 1E23在这三种McAb中显示出对rCPB2毒素蛋白和天然CPB2毒素蛋白最宽泛和最特异性的免疫学反应，而且其对rCPB2的免疫荧光分析染色还示踪证实了rCPB2首先通过与细胞膜结合，然后跨膜转移至细胞质的动态变化过程；3.纯化rCPB2毒素刺激NCM460后诱导了Caspase依赖性的细胞凋亡程序，这一过程具有毒素作用剂量和时间的依赖性，同时伴随着细胞线粒体膜电位下降、促凋亡蛋白Bax等的表达水平的上调，抗凋亡蛋白Bcl-xl等的表达水平的下调。4.通过尾静脉注射和灌胃两种途径将纯化rCPB毒素分别作用于成年小鼠和乳鼠后，检测小鼠血清、小肠和脾脏组织中Th1、Th2、Th17 细胞亚群分泌的细胞因子变化的结果显示，rCPB2处理的成年小鼠和乳鼠的血清、小肠和脾脏组织中IL-1β等含量均与未处理组有显著性差异，提示rCPB2体内毒性作用过程可能与诱发机体的炎症反应相关。综合以上结果，我们推测产气荚膜梭菌Beta2毒素刺激动物肠黏膜上皮细胞的损伤机制可能是：Beta2毒素产生后，会在短时间内结合到宿主细胞膜上，并迅速转运至胞浆，刺激靶细胞TNF-α等炎性细胞因子的表达并发生炎性反应，同时破坏了受刺激细胞的线粒体膜的完整性，并积累过量的ROS，启动了依赖Caspase的细胞凋亡途径，造成受刺激细胞的凋亡，进而造成动物肠道的损伤，引发动物肠炎的发生。