神经退行性疾病共济失调伴眼动失用症发病机理的结构生物学研究

Ataxia with oculomotor apraxia type 1 (AOA1) is an autosomal recessive neurological disorder caused directly by the mutation and dysfunction of human aprataxin, a DNA single-strand break repair protein. Aprataxin is DNA 5'-deadenylase, and the crystal structures of Schizosaccharomyces pombe aprataxin Hnt3 in its apo form and in complex to DNA were published by us last year. The key catalytic residues were determined and the catalytic model "DNA 5'-flap conformation" was proposed. However, because the model is still controversial, we need to further solve the crystal structure of aprataxin in complex with its active substrate 5'-AMP-DNA adduct. At the same time, human aprataxin shares an overall 26% sequence identity with yeast Hnt3, and its crystal structure has not been determined yet. This project takes aprataxin and AOA1 as the subjects with the aim to solve these two problems. On the one hand, the crystal structure of aprataxin in complex with its active substrate 5'-AMP-DNA adduct will be studied through preparing inactive mutation of aprataxin and 5'-AMP-DNA adduct. One the other hand, we will determine the crystal structures of human aprataxin in complex with different kinds of DNA. On the basis of structural biology, the molecular mechanism of AOA1 will be further revealed, and the project is expected to provide new ideas for the design and development of human AOA1 drugs.

共济失调伴眼动失用症AOA1属于常染色体隐性遗传神经退行性疾病，其发病与DNA单链损伤修复蛋白Aprataxin 的突变直接相关。Aprataxin是DNA修复系统的一个重要环节，无论是在对疾病的诊断和治疗方面还是在揭示生物体如何保持遗传物质稳定方面，对Aprataxin的研究均具有重要意义。我们已经发表了Aprataxin在裂殖酵母中的同源蛋白Hnt3与DNA复合物的晶体结构，但是最终确认这个催化模型还需要模拟出酶与底物形成的催化中间过渡态，同时人源Aprataxin的结构至今尚未报道。本项目将一方面通过获得完全失活的Hnt3突变体和制备5'-腺苷酸-DNA加合物，来研究Hnt3的催化中间过渡态复合物的晶体结构，另一方面将研究人源蛋白与DNA复合物晶体结构。本项目将在结构生物学的基础上阐明Aprataxin的催化机理，揭示AOA1发病的分子机制并提供药物设计开发所需的理论基础。

人类神经退行性疾病共济失调伴眼动失用症AOA1的发病与神经毒性物质5'-腺苷酸-DNA在人体内的积累直接相关。DNA单链损伤修复蛋白Aprataxin是DNA的5'-去腺苷化酶，可催化去除5'-腺苷酸-DNA上的5'-腺苷酸，使因错失而中断的DNA连接反应得以逆转，该蛋白在人类AOA1疾病恢复过程中起到至关重要的作用。编码该蛋白的基因APTX的遗传突变可直接导致AOA1疾病的发生。因此，研究Aprataxin蛋白的分子机制和结构基础具有重要意义。.本项目的研究内容主要集中在Aprataxin蛋白与DNA 复合物的结构与功能研究。我们利用分子生物学和结构生物学手段，开展了Aprataxin类似物来源于酵母的Hnt3完全失活突变体蛋白与不同种类产物DNA或活性底物5’-腺苷酸-DNA复合物的晶体结构研究，同时开展了人源Aprataxin蛋白的结构与功能研究等。.本项目的重要研究结果是我们共解析了4种不同种类复合物高分辨率三维结构，包括酵母Hnt3完全失活突变体与产物DNA复合物1.9埃分辨率的晶体结构、2种不同类型的Hnt3完全失活突变体与产物DNA和AMP复合物分别为2.4和2.1埃分辨率的晶体结构，以及成功建立了5’-腺苷酸-DNA生物酶高效合成平台，并在此基础上获得了活性底物5'-腺苷酸-DNA加合物与Hnt3完全失活突变体复合物2.64埃分辨率的晶体结构。并在三维结构的基础上获得了功能研究数据。.本项目的科学意义是通过高分辨率结构的解析，我们首次获得了Aprataxin蛋白和活性底物在反应前的构象状态，并清楚的阐明了其在催化反应前后与DNA间的分子相互作用变化的整个过程，精确确定了发挥功能的若干关键残基，从而清楚准确地揭示了Aprataxin的酶催化机制。项目研究结果为共济失调伴眼动失用症AOA1的分子机制研究提供精确可靠的实验数据，同时为相关创新生物医药研发提供重要的结构基础。

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