米曲霉胞外蛋白酶在酱油酿造过程中的表达规律研究及耐盐蛋白酶挖掘

The extracellular proteases secreted by Aspergillus oryzae are complicated because of the 134 genes of proteases in the whole genome sequences. The expression level，distribution and the activity of proteases can be affected by fermented factors. It’s difficult to analyze the systematic expression levels of these proteases for a long time, but proteomic approach is a good method to study the expression profile in the fermentation of soy sauce. This project is on the basis of the earlier research of the whole genome sequences and intracellular proteomics, and the protease activity under the soy sauce fermented conditions will be studied. The map of extracellular proteases secreted by A. oryzae 3.042 will be displayed by analyzing the expression levels of proteases using proteomic approach. The composition of the proteases in the key fermented periods will be compared. The changes of protease expression will also be analyzed and identified to uncover the mechanism of proteases expression profile. Subsequently, some salt-tolerant proteases will also be found in the project. In order to clarify the functional mechanism of the proteases, conserved sequence and functional domain will be analyzed using bioinformatics methods. The combined results will help us to provide theoretical guidance to optimum utilization of protease, and to increase the utilization ration of protein raw material during the fermentation of soy sauce.

米曲霉基因组中有134个胞外蛋白酶基因，胞外蛋白酶系组成十分复杂，酱油酿造条件直接影响这些蛋白酶的表达、分布和活力。长期以来，由于条件的局限，一直没有对蛋白酶进行系统性研究，现代组学为蛋白酶的系统研究开辟了新的途径。本项目在前期米曲霉3.042菌株全基因组测序和胞内蛋白质组学的研究基础上，分析环境因子与米曲霉3.042胞外蛋白酶动力学曲线之间的关系；通过对蛋白酶活力变化显著的发酵关键阶段的蛋白质组学研究，绘制米曲霉胞外蛋白酶系表达图谱；利用比较蛋白质组学的手段研究酱油发酵关键阶段蛋白酶系的组成；分析米曲霉3.042胞外蛋白酶系在酱油酿造过程中的表达规律；挖掘高盐环境胁迫条件下的耐盐蛋白酶种类；分析耐盐蛋白酶的保守氨基酸序列及结构功能域，研究其耐盐机制。研究结果为实现米曲霉胞外蛋白酶的合理高效利用提供理论指导，对于解决酱油酿造过程中蛋白质原料利用率低的问题提供理论依据。

通过模拟米曲霉高盐稀态酱油发酵过程，研究酱油发酵过程中具体风味物质的变化情况，探究蛋白酶在酱油酿造过程中的表达情况。本课题预测了6种耐盐蛋白酶的空间结构。此外，通过蛋白分离纯化实验，对米曲霉的耐盐蛋白酶进行了初步分离纯化，及酶学性质研究。结果如下：.1.采用SPME-GC-MS方法检测高盐稀态发酵酱醪中风味物质。结果表明，酱醪在发酵0-6个月的过程中，发酵前期，酱醪以醇酚类、醛类为主；发酵中期，酱醪以醇酚类、酸类、醛类为主；发酵后期，酱醪以醇酚类、酸类、酯类、含氮化合物为主。其中，乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、3-甲基吡嗪、苯甲醛和苯乙醛是重要的风味物质组成，与12种市售酱油重要的风味物质成分情况相符，使酱油具有相似的风味。.2. 利用Label free非标记定量技术对发酵前期、中期、后期酱醪盐析所得酶液进行蛋白质组学测定。酱醪样品中的蛋白按照功能主要分为与氨基酸代谢有关的蛋白质、与糖代谢有关的蛋白质、与核苷酸代谢有关的蛋白质和其它功能。随着发酵进行，蛋白酶种类和强度均呈递增状态，蛋白酶分泌情况在发酵中、后期差异小于发酵前、中期。通过PDB网站查询，未找到发表的米曲霉耐盐蛋白酶结构，经过swiss-model在线分析软件，进行了6种耐盐蛋白酶的结构预测。.3. 通过硫酸铵盐析、阴离子交换层析、凝胶层析分离纯化米曲霉耐盐蛋白酶，得到相对分子大小约为50 kDa、电泳纯度的耐盐蛋白酶。提纯所得蛋白酶比酶活为460.53U/mg，酶活收率为1.70%，纯化了5.70倍。测定纯化蛋白酶的酶学性质，包括最适pH、最适温度、热稳定性、金属离子对蛋白酶活力影响。结果表明，纯化蛋白酶的最适pH为7，属于中性蛋白酶。作用的最适温度为50℃，在45-55℃间能保持较高酶活。纯化蛋白酶在30℃和40℃条件下能保持稳定状态，50℃条件下保温酶活开始有较大变化，在60℃和70℃条件下，酶活下降迅速。Mn2+对纯化蛋白酶有激活效果，K+，Mg2+，Fe3+对酶活有轻微抑制作用，Ca2+，Zn2+，Cu2+对酶活有明显抑制作用。

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