DNA-PKcs磷酸化簇区域在辐射致DNA损伤修复中的功能及其抗体的辐射增敏机制

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81172119
项目类别：
面上项目
资助金额：
55.0万
负责人：
周丽君
依托单位：
中国人民解放军总医院
学科分类：
H1821.肿瘤治疗抵抗
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
刘晓丹；王欲晓；曲佳；汪黎；李兵；解鹏；何立东；齐文杰；
关键词：
DNA-PKcs 人源抗体 Akt/GSK3β信号通路

项目摘要

DNA-PKcs是细胞DNA双链断裂非同源末端连接修复途径（NHEJ）的关键分子，其功能过表达会导致癌细胞的辐射耐受，放射治疗失败,被视为是一个肿瘤治疗的理想靶标。在上一自然基金的资助下，我们获得了针对DNA-PKcsN端多磷酸化簇区域的特异性人源抗体(anti-DPK3-scFv)，通过多项实验初步证实了该单链抗体具有辐射增敏活性。本课题一是借助分子文库技术高通量筛选与DNA-PKcs抗原表位区域（ DPK3磷酸化丛区域）相互作用的蛋白，通过这些蛋白研究该区域在DNA损伤及细胞周期进程的功能；二是通过评价γ线照射后抗体对细胞DNA修复能力、DNA-PKcs及其多个底物分子的表达、磷酸化和活性变化（DNA-PKcs/Akt信号通路相关底物和效应），阐明anti-DNA-PKcs-scFv对肿瘤细胞的辐射增敏分子机制。为发现抗肿瘤药物的新靶点及研发具有自主知识产权的分子靶向药物打下理论基础。

结项摘要

DNA-PKcs 是细胞DNA 双链断裂非同源末端连接修复途径（NHEJ）的关键分子，其功能过表达会导致癌细胞的辐射耐受，放射治疗失败,被视为是一个肿瘤治疗的理想靶标。在本研究中，首先以构建好的含有DNA-PKcs AA1961-AA2210磷酸化簇区域的肽段为诱饵蛋白，采用酵母双杂交技术与人胎肝酵母文库筛选，初步获得7种长度互不相同的文库克隆，并通过构建真核表达载体、将诱饵蛋白与猎物蛋白共转染至真核293T细胞，经Western Blot验证、CO-IP实验最终获得3个与DNA-PKcs 磷酸化簇区域相互作用的蛋白；通过文献调研选择其中的盐诱导激酶2（SIK2）开展相关研究，探讨电离辐射对其的诱导表达作用。通过Real-time PCR和Western Blot方法分别测定了60Co γ 射线照射后HepG2细胞 SIK2 mRNA 表达及SIK2 蛋白表达水平变化，显示照射剂量对二者均有一定的影响，但时效性与剂量关系并不明显。为更好研究DNA-PKcs多磷酸化区域与SIK2的相互作用、在DNA损伤及细胞周期进程中的功能，率先制备成功SIK2条件基因敲出鼠。其次，在对培养及诱导条件优化的基础上，使anti-DPK3-scFv抗体在大肠杆菌中获得高效表达；并运用亲和层析的方法最终获得纯度达到95%的抗体蛋白；同时使用Sigma TECT DNA依赖蛋白激酶分析系统检测了单链抗体对DNA-PKcs激酶活性的影响，证实了纯化后的抗体在体外能够有效抑制DNA-PKcs 激酶的活性；采用共聚焦显微镜观察显示该抗体能够自动穿过细胞膜进入细胞内并逐渐进入细胞核与DNA-PKcs共定位，证实在细胞内该抗体具有较高的特异性；进一步采用Western 印迹分析和免疫荧光显微镜观察结果同样证实：该抗体对辐射诱发的HeLa细胞DNA-PKcs 表达和其pS2056 磷酸化具有一定的抑制作用。最后，在完成抗DNA-PKcs抗体真核表达载体构建的基础上，继续在细胞与整体水平开展抗体对肿瘤细胞的辐射增敏作用及相关机制研究。结果显示：抗体能够明显提高照射后肿瘤细胞的辐射敏感性，进一步机制研究发现该抗体明显抑制照射后肿瘤细胞的Akt磷酸化水平，并通过提高细胞凋亡途径中关键分子Caspase-3的活性促进肿瘤细胞的凋亡。本研究为anti-DPK3-scFv的进一步研发奠定良好的理论基础。