直接构建仿生酶/生物基活细胞生长的自支撑传感器及其高灵敏原位实时检测细胞释放的NO

Nitric oxide (NO) plays a significant role in the regulation of various cell functions. But, excessive NO generation may cause cell damage and pathology, makes it very critical to quantitatively and in situ monitor NO released from living cells. However, due to its fast diffusion, short half-life, low concentration and easily reacting with other surrounding molecules, in situ detection of NO remains a huge challenge. Based on her experiences on fabrication of highly sensitive biosensors and sensing of cell-released signaling molecules, the applicant reports a new approach to directly grow living cells on iron porphyrin (FeP) modified hierarchical porous carbon fiber network (CFN, synthesized by carbonizing silk cocoon) as a smart free-standing electrochemical biosensor with great sensitivity and selectivity. FeP shows high electroactivity toward NO as biomimetic enzyme, CFN with high conductivity, biocompatibility and three dimensional porous structure provides excellent electron transport and cell attach/growth scaffold, while the directly growing cell on the biosensor offers short diffusion distance between cell-released NO and reaction sites, which minimizes NO decay during diffusion. Thus, this design significantly increases sensitivity of the constructed biosensor and realizes NO detection at cellular level. Besides, this project is expected to provide fundamental understandings of pathology mechanism caused by NO through investigating relation between cytopathic extent and cell released NO concentration.

一氧化氮(NO)对细胞多种生命活动起着非常重要的介导作用，但其含量失调时，会损害细胞甚至引发病变。因此，实时定量检测细胞NO释放量至关重要。然而，NO扩散快、半衰期短且含量低，实现细胞水平上原位检测NO极具挑战性。本项目基于申请人高灵敏生物传感器构建及细胞信号分子实时检测的工作基础，拟设计卟啉铁(FeP)修饰的生物材料如碳化蚕茧制备的碳纤维网(CFN)，并将细胞直接生长在该复合材料网上，以构筑超灵敏和高选择性自支撑电化学传感器，FeP对NO显示高效特异电催化活性，可作为NO仿生酶；CFN具有高导电性、生物相容性和三维多孔结构，提供了电子快速传递载体和细胞生长平台；此外细胞直接生长在传感器上可有效缩短其释放NO与催化中心扩散距离，减少了NO在扩散过程中的衰减，极大提高了传感器灵敏度，实现细胞水平上实时检测NO。同时探究细胞病变程度和其NO释放量的关系，为揭示NO引发疾病机理提供一定理论贡献。

细胞是生物体新陈代谢的基本单元，实时检测其释放的具有特殊生理功能的生物活性小分子对于探索细胞生理和病理活动机制具有重要的科学意义，同时也对相关疾病诊断和药物研发具有实际指导意义。本项目设计并制备了可供细胞直接生长的三维碳纤维（CFN）/hemin电化学传感平台，实时高灵敏检测活细胞的NO释放量。蚕茧为前驱体制备的CFN传感器提供了良好的生物相容性及维度匹配的细胞生长平台，通过缩短细胞释放的NO 与响应活性中心的距离极大地提高了传感器对NO的捕获率和检测灵敏度。Hemin可逆的Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化还原电对可用作NO仿生酶，为细胞释放痕量NO的原位实时检测提供了有力保障。其次，设计研发了一种独特的多功能铂纳米颗粒修饰的3D石墨烯海绵自支撑传感器，其为细胞的粘附生长提供了优良的平台，可实现原位实时监测活细胞释放的O2•−。在此研究基础上，进一步设计具有异质结特异结构的材料Mn3PO4/Mxene，并制备柔性生物传感器，以期推广应用到实际检测中；此外，本项目也通过改进检测方法，采用光电检测技术在提升检测灵敏度的基础上，保证制备的传感器兼具优异的选择性；在理论研究方面，项目也极力创新，设计制备单原子钴纳米酶，在单原子尺度上深入研究催化机理。设计并合成钌单原子材料，用于多巴胺和尿酸的同时检测，实现更高效的纳米酶催化。科学意义在于，本项目的实验数据及结果为进一步探索生物体中酶的催化机理提供了分析思路，此外，通过检测癌细胞释放的多种活性小分子标记物，为相关疾病的发生机理及治疗方案提供一定的理论基础。本项目的应用前景在于，构建的柔性生物芯片有望推向市场，用于血清中常见疾病标志物的检测。发表SCI研究论文10篇（IF>10的3篇，一区6篇，二区3篇）；申请发明专利10件，授权1件。参加国际学术会议1次，并作会议邀请报告，国内学术会议1次。培养硕士研究生4名。

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