人腺病毒E1B55K与E4orf6蛋白相互作用的型特异性研究及应用

Human adenoviruses are classified into seven species (A-G) including more than fifty serotypes, and have the potential for gene therapy and recombinant vaccine vectors. HEK293 cells, which constitutively express Ad5 E1 genes, are used as the packaging cells for adenoviruses. The major function of E1B5KK is relevant to E4orf6 protein and they can form E3 ubiquitin ligase complex. E1B55K from different groups could not be complemented very well as it was reported that E1-deleted recombinant adenovirus only could be multiplied in the 293 cells which expressing respective E1 protein. It is possible that E1B55K and E4orf6 from different groups could not form the E3 ubiquitin ligase complex. In this study, we will study the interaction of adenovirus E1B55K and E4orf6 from Ad5 and Ad41, the formation and function of E3 ubiquitin ligase complexes and degradation of the substrates. Co-immunoprecipitation will be employed to analyse the interaction. Moreover, we will validate the hypothesis that the E3 ubiquitin ligase complex cannot be formed by heterotypic E1B55K and E4orf6. This work will facilitate further study of the biological function of adenovirus E1B55K and E4orf6, also, it will provide new construction strategy for adenoviral vector and is beneficial for the utilization of adenovirus.

人腺病毒分为50多个型，有开发为不同用途基因治疗或重组疫苗载体的潜力。293为人5型腺病毒（Ad5） E1区转化的细胞，多个研究发现E1区缺失的腺病毒载体只能在表达该型E1B55K蛋白的293细胞增殖，说明Ad5 E1B55K不能代替其他型同源蛋白的功能，E1B55K可能具有型特异性，推测该特异性与E1B55K-E4orf6蛋白相互作用有关。本课题以Ad5和Ad41为模型，利用免疫共沉淀技术，观察同型或异型E1B55K-E4orf6相互作用情况，并检测E1B55K-E4orf6相互作用引发的E3泛素连接酶复合物形成、功能变化；通过对Ad41载体系统E4orf6基因的分子改造，验证E1B55K-E4orf6相互作用具有型特异性的假说。该研究将深化对E1B55K和E4orf6蛋白调控腺病毒复制分子机理的认识，提供新型腺病毒载体的构建策略，有利于加速腺病毒载体资源的开发利用。

同型腺病毒早期蛋白E1B55K与E4orf6通过相互作用形成E3泛素连接酶复合体来行使其主要功能，然而异型腺病毒E1B55K与E4orf6蛋白之间能否相互作用并不清楚。本研究选取Ad5和Ad41作为模型，利用免疫共沉淀技术，观察了同型或异型E1B55K与E4orf6蛋白之间的相互作用，并检测了E3泛素连接酶复合物的组成及功能等情况，研究结果表明，Ad5 E4orf6能与Ad41 E1B55K蛋白相互作用，但却无法降解细胞内Mre11，p53等底物蛋白，而Ad41 E4orf6不但能与Ad5 E1B55K蛋白相互作用，而且形成的E3泛素连接酶复合物能降解细胞内Mre11，p53等底物蛋白。尽管如此，我们通过进一步的实验，发现Ad5 E1B55K并不能完全替代Ad41 E1B55K的功能，这可能与病毒晚期mRNA出核转运有关。基于以上研究结果，我们对Ad41载体系统进行了优化，在Ad41骨架质粒上添加Ad5 E4orf6基因，构建了新型重组腺病毒Ad41E4EEGFP，该病毒实现了在293细胞中培养Ad41的目的，同时也验证了E1B55K-E4orf6相互作用具有型特异性的假说。本研究为新型腺病毒载体的构建提供了思路，有利于加速腺病毒载体资源的开发利用。

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