载AKt1 shRNA表达质粒DNA的新型多功能基因给药系统的构建及用于肺癌治疗的研究

对于肿瘤的基因治疗，研制具有安全性、有效性和肿瘤靶向性的载体是面临的主要挑战。已成功合成了叶酸-三甲基壳聚糖和叶酸-聚乙二醇-三甲基壳聚糖，可利用"水凝胶效应"帮助基因逃逸溶酶体，且可利用叶酸受体介导选择性地提高叶酸受体表达肿瘤细胞中的基因转染率。为减少聚合物用量以减小载体的毒性，将上述聚合物共价结合到载氯喹的PLGA纳米粒表面得到新型的载体。PLGA纳米粒中的氯喹为逃逸溶酶体辅助剂，被包裹于纳米粒可避免对正常组织的毒性。另外，制备荷正电的叶酸-脂质包裹载氯喹PLGA的纳米粒，同样有望通过减少阳离子脂质用量以减小载体毒性。基于多种理论设计的上述三种新型多功能阳离子载体在国内外未见类似报道。以对肺癌有确切作用的AKt1 shRNA表达质粒DNA为模型，用上述载体治疗新型给药系统。若项目顺利实施，不仅可以丰富肺癌基因给药系统的研究内容，也为基因治疗提供了新方法和新制剂，有较高学术和实用价值

PLGA具有优良的生物降解性，但其作为基因载体仍然存在包封率低、转染率低等缺陷，故常与其他材料联合应用。本研究采用经典的磷酸钙作为基因缩合剂，先制备载GFP表达质粒的CaPi-pDNA复合物，再制备镶嵌CaPi-pDNA复合物的PLGA纳米粒（简称为CP）。所得纳米粒包封率大于90%，远高于单纯的PLGA纳米粒。DSC实验结果提示PLGA与磷酸钙之间有相互作用。纳米粒比表面积测定结果表明其具有成介孔材料的性质，且其孔隙率高于单纯的PLGA纳米粒。该纳米粒在普通储存条件下稳定性好，且具有抵抗核酸酶对pDNA降解的能力。以HEK293作为模型细胞，CP转染率显著高于普通的载pDNA的PLGA纳米粒。阿霉素（DOX）缺乏肿瘤特异性及抗药性有关。Survivin的34位基因突变体Msurvivin T34A被报道能在肿瘤细胞中引起细胞抗凋亡作用的下降，并调节有丝分裂。我们设想用我们构建的新型CP包载Msurvivin T34A基因，能在给予DOX的肿瘤细胞中持续表达，利用Msurvivin T34A对survivin蛋白的调控以避免DOX敏感性降低，达到协同抗肿瘤的效果。本课题分别制备了载Msurvivin T34A pDNA和空白质粒null的CP,分别简称为Msurvivin T34A-CP和null-CP。体外细胞实验表明，Msurvivin T34A-CP+Doxcil可造成乳腺癌4T1细胞出现晚期凋亡或者坏死，也可造成其周期阻滞，较单独的Msurvivin T34A-CP和Doxil处理组均有显著性差异。以荷4T1的BALB/c小鼠为模型，Msurvivin T34A-CP(i.t.)+Doxcil(i.v.)联合组可明显抑制肿瘤生长，肿瘤组织切片中可见大量凋亡细胞，VEGF和CD31免疫组化表明肿瘤新生血管出现明显抑制，与单独的Msurvivin T34A-CP和Doxcil处理组均有显著性差异。CP纳米粒子表面主要呈疏水性，若经过静脉给药则容易被RES系统识别而被清除，本研究采用含PEG-DSPE的脂质层对CP进行亲水化修饰，修饰后的纳米粒简称为LCP。LCP与CP相比对质粒的包载能力并无改变。以DiR为荧光探针，经过静脉给予小鼠，用活体荧光监测发现LCP的体内循环时间较CP明显延长，表明亲水化修饰可减慢CP的消除，所得的LCP有望实现静脉给药。

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