新型pH响应载体转导靶向Met/VEGFR2受体基因抑制恶性胶质瘤及其放疗增敏功能及机制研究

It has been documented recently that Met and VEGFR2 is physically connected in cancer cells of glioblastoma,which play a critical role for the therapeutic resistances of iron radioation(IR) and antiangiogenesis in patients with glioblastoma. Based on our previous studies and more recent preliminary data, we proposed here that development of a novel gene therapy with pH-sensitive PEGylated-H1(PH1) mediated CpG-free plasmids encoding E27RHK, a fusion gene composed of the core domain of Endostatin and HGFK1 targeting against Met/VEGFR2 receptors complexes will produce the optimal therapeutic efficacies for glioblastoma. In this application, we will: 1) develop a pH-sensitive PEGlate-H1(PH1) that is a biodegradable, low toxicity and high efficacy gene delivery vector with the ability of tumor targeting and penetration of the blood brain barrier; 2) develop a novel fusion protein E27RHGFK1 to target against Met/VEGFR2 receptors complexes in cancer cells of glioblastoma; 3) determine the antitumoral efficacy and IR sensitized abilities of PH1/pE27HK to glioblastoma as compared with the PH1/pHGFK1, PH1/pE27 and PH1/pHGFK1+PH1/pE27 in the nude mice with orthotopic glioblastoma xenografts; (4) elucidate the underlying mechanisms/ downstream targets of E27HK if we get the expected results from the proposed studies. Knowledge gain from these studies will provide new insights, and identify novel mechanisms / new therapeutic targets for the treatment of glioblastoma.

Met/VEGFR2受体表达在恶性胶质瘤细胞并形成受体复合物，协同调控胶质瘤干细胞与血管生成，对放疗和抗血管生成治疗抵抗具有关键作用。发展靶向抑制该复合受体的基因治疗药物，具有重要临床应用价值和理论意义。在前期工作基础之上，申请人将在此项目中完成：1、发展具有PH响应特性的新型脑胶质瘤靶向性、高效、低毒的基因药物传递新技术；2、发展细胞外靶向Met/VEGFR2复合受体的融合多肽及基因治疗新技术；3、在细胞模型和小鼠原位移植人源化脑胶质瘤模型上，比较研究PH1转导的HGFK1、 E27RHK、E27对胶质瘤的抑瘤功能及放疗增敏作用，并研究相关分子机制。为发展新型抗血管生成及放疗增敏胶质瘤基因治疗药物打下基础。

HGF/Met信号通路异常活化在调控放疗及抗血管生成治疗抵抗中具有重要作用。最新研究发现，胶质瘤细胞在Met 受体靶向抑制后，可能通过 VEGF/VEGFR2 的补充激活途径，再次激活肿瘤的生长。同时，Met 与 VEGFR2 又连接成复合物表达于胶质瘤细胞表面；因此同时靶向抑制 Met和VEGFR2 受体复合物，可能具有更佳的抗胶质瘤作用。因此，本课题将Met 受体拮抗剂HGFK1 与VEGF受体拮抗剂 Endostatin 功能肽 E25 构建成融合多肽（命名为EL2HK1），以此同时靶向抑制 Met和VEGFR2 受体，从而发挥放疗增敏作用和更强的抑瘤功能。.本课题首先发展了一种神经胶质瘤靶向性纳米粒子。课题组早期发展了聚阳离子载体 H1，H1具有较强基因递送能力。为延长纳米粒子的体内循环时间，增加其肿瘤靶向能力，我们将PEG与PEI-CyD嫁接形成PEG-PEI-CyD，并进一步将H1与PEG-PEI-CyD按照等氮比混合，形成新的基因载体PH1。PH1能增加纳米粒子在体内的循环时间，使之有更多机会在肿瘤组织中蓄积。本项目在免疫正常 Balb/c小鼠和原位胶质瘤裸鼠上，腹腔注射 PH1包裹质粒形成的纳米粒子后，结果发现，小鼠脑胶质瘤细胞被大量转染上了注射的质粒。证明了PH1 能携带基因透过血脑屏障，提示其在脑胶质瘤基因治疗中具有重要应用价值。.进一步利用PH1作为基因治疗载体包裹EL2HK1质粒对裸鼠原位脑胶质瘤进行治疗。结果发现，PH1/EL2HK1纳米粒子可以显著抑制裸鼠脑胶质瘤生长及延长了小鼠生存期。细胞实验和免疫组化结果证实EL2HK1可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，且显著抑制肿瘤内血管生成。体内外实验均显示，与单纯脑胶质瘤放射治疗相比，放疗联合EL2HK1治疗效果更好，即EL2HK1具有明显的放疗增敏作用。Western-Blot方法研究EL2HK1重组蛋白的作用机制显示，VEGFR2及Met蛋白表达均被显著抑制。因此，PH1/EL2HK1纳米粒子联合放射治疗为临床提供了一种新型脑胶质瘤治疗方案。

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