福建马蓝有效成分形成的分子途径解析与关键酶调控

The indigo is cold, and salty taste, it has effects of clearing away heat and detoxification, cooling blood and hemostasis, clearing liver-fire and arresting convulsion，et al . The main components of indigo is a bis-indole alkaloid analogs ( Indigo, Indirubin), pharmacological research showed that indigo can anti-microbial, improve immune, and insurance liver, the indirubin were anti-tumor and auxiliary drug for tumor treatment, it used to treatment chronic grain cell leukemia effectively in clinical, therefore, the Indigo is used widely to treatment various swelling, inflammation, variety virus disease, and leukemia. The Indigo originated from processing products of the indigo plant, the indole derivatives as its precursor substances inside plants, the Fujian Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek is a main original plant of the indigo, the genetic background of the indigo plant have also not clearly, the synthesis information of the indole alkali com from presumption based on microbial indigo metabolism. This research intends using transcriptomics, and functional genomics analyses synthesis molecular information of the indole alkali, silence and over-expression regulated gene function of the key enzymes (Tryptophan Synthase,TSB,Cytochrome P450 monooxygenase,CYP450), combines analysis of the metabonomics on metabolism spectrum of the indole alkaloid analogs, this research objective is that preliminary analyses synthesis of the molecular pathways of the active ingredients in the Fujian Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek, and regulates genes of the key enzyme to increase contents of the indole alkali, which is very important to promote research and regulation of secondary metabolism in medicinal plants.

中药青黛性寒,味咸,具有清热解毒；凉血止血；清肝泻火定惊等功效, 青黛主要成分为双吲哚生物碱靛蓝、靛玉红，药理学研究表明,靛蓝具有拮抗原微生物、提高机体免疫、保肝等药理作用, 靛玉红为抗肿瘤和肿瘤治疗辅助药物，临床可有效治疗慢性粒细胞性白血病，因此，青黛广泛用于治疗各种肿痛，炎症和多种病毒性疾病及白血病。青黛源于蓝靛植物加工，吲哚类化合物为其体内前体物质，福建马蓝是青黛主要原植物，有关蓝靛植物的遗传背景目前还不清楚，体内吲哚生物碱形成信息多基于微生物靛蓝合成代谢的推定，本研究拟运用转录组学、功能基因组学解析马蓝吲哚类生物碱形成的分子信息，采用功能基因沉默和过表达吲哚合成酶（TSB）、吲哚氧化酶（CYP450）基因，结合代谢组学对吲哚类物质代谢谱学分析，解析马蓝有效成分形成分子途径，通过调控关键酶基因，达到提高马蓝吲哚生物碱含量的目的，研究对推动药用植物次生代谢研究和调控具有重意义。

福建马蓝是中药青黛主要原植物，其主要成分为靛蓝(indigotin)、靛玉红(indirubin)和异靛蓝（isoindigo）。靛蓝为双吲哚生物碱，药理学研究表明，其具有拮抗原微生物、提高机体免疫功能、保肝等药理作用，靛玉红为靛蓝的同分异构，是抗肿瘤和肿瘤治疗辅助药物。有关蓝靛植物体内吲哚生物碱形成信息多基于微生物靛蓝合成代谢的推定，本研究对马蓝根茎叶及土壤中无机元素和有效成分的累积特征，茉莉酸甲酯处理对叶片光学特征的影响进行了分析，并通过马蓝转录组测序及注释，筛选到吲哚类生物碱合成途径的关键酶（EPSPS、CS、CYP450、TSA、ASA、SGD等），检测到16种类型的简单序列重复序列，获得转录调控相关转录因子。进一步的分离鉴定出9种关键酶基因序列，应用生物信息学对马蓝有效物质形成分子途径关键基因基本特征进行预测和分析。通过实时荧光定量PCR分析关键酶基因在不同组织中的表达模式，外源激素处理检测了不同时间点基因表达水平的变化。原核表达获得EPSPS、CS、CYP450等基因的重组蛋白，并对纯化蛋白进行了酶活力测定。通过农杆菌介导转化拟南芥及菘蓝叶盘，获得相应过表达植株和毛状根，qRT-PCR测定表明过表达植株和毛状根相关关键酶基因最高表达量增加。靛蓝、异胡豆苷、吲哚、吲哚苷等有效成分含量测定表明，过表达关键酶基因能促进了下游产物的积累，证实了关键酶基因在吲哚类生物碱合成中的正向调节作用。通过体内和体外的功能验证，揭示了关键酶基因在马蓝吲哚类生物碱合成途径中的作用，明确了蓝靛植物中的吲哚生物碱合成途径。

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