内质网分子伴侣GRP78通过自噬调节染氟LS8细胞的毒性反应

Glucose regulated protein 78 (GPR78) plays an important role in endoplasmic reticulum stress. Fluoride can induce the endoplasmic reticulum stress response in the ameloblast, and reduce the toxicity of fluoride by autophagy, maintain the stability of the cells. The excessive Glucose regulated protein 78 (GRP78) plays an important role in endoplasmic reticulum stress. Fluoride can induce the endoplasmic reticulum stress response in the ameloblast and autophagy reactions at the same time. Whether the occurrence of these two phenomena is causality, how is its regulating mechanism? This study concerns and intends to solve the problem that the occurrence of autophagy is to reduce or aggravate the toxicity of fluoride. According to our previous studies, we supposed that fluoride induced endoplasmic reticulum stress in ameloblast, and through the GRP78- IRE1-TRAF2-JNK pathway regulated ameloblast autophagy, which reduced cytotoxicity of ameloblast. This research attempts to verify the hypothesis through animal experiments and cell culture experiments. We adopt ameloblast transfection of mRFP-GFP-LC3, overexpression and interference of GRP78 transfect in ameloblast, and siRNA and inhibits methods to study following problems:1. the relationship between autophagy and fluorosis in ameloblast and its roles. 2. the relationship between endoplasmic reticulum molecular chaperone and autophagy and these possible regulatory mechanisms This subject is helpful to increase the understanding of the molecular biological mechanism of dental fluorosis, and provide a theoretical basis for the prevention and treatment of dental fluorosis.

葡萄糖调节蛋白78（GRP78），在内质网应激中发挥了重要的调节作用。氟可以诱导成釉细胞出现内质网应激反应(ERs)，同时伴有自噬反应的发生。这两种现象的出现是否为因果关系，其调节机制如何？自噬反应的出现是减轻还是加重了氟的毒性作用是本研究关心和拟解决的课题。根据前期研究基础，我们提出假设：当氟化物作用于成釉细胞时，内质网应激反应被激活，GRP78通过GRP78-IRE1-TRAF2-JNK通路调控自噬反应，以应对氟对成釉细胞的毒性作用。本研究通过动物实验和离体细胞培养试验，采用染氟成釉细胞转染双标LC3腺病毒、通过建立干扰和过表达GRP78稳转细胞株，采用沉默基因表达和抑制酶活性等手段开展以下研究：1.成釉细胞内的自噬反应与氟中毒的关系及其作用；2. 内质网分子伴侣与自噬的关系及可能的调节机制。该课题的研究有利于增加对氟牙症发病的分子生物学机制的认识，为预防氟牙症的发提供新的思路和新途径

氟牙症发生是由于在釉质形成过程中釉质相关蛋白水解、清除障碍导致的釉质矿化异常。内质网应激反应是成釉细胞功能障碍的核心，内质网应激反应可以引起细胞凋亡、自噬过程的发生，最终引起成釉细胞的功能障碍、形态变化。在本研究中，通过建立动物模型，和小鼠LS8细胞染氟模型，探讨了沉默LS8细胞的Atg5和Atg7基因时，LS8细胞凋亡减少的发生，说明通过调节ATG5和ATG7抑制自噬可以降低氟诱导的LS8细胞凋亡的发生。3-MA和Baf-A1在氟化LS8细胞自噬的抑制中虽然发挥不同的作用，但它们对凋亡的影响是一致的，抑制自噬可以减轻氟诱导的LS8细胞凋亡。氟化物可以引起LS8细胞发生内质网应激反应，抑制釉质形成过程中蛋白质的合成和分泌。分子伴侣GRP78作为内质网的标记物，可以与错误折叠或未折叠蛋白的疏水残基结合，减少错误折叠或未折叠蛋白在内质网中的积累，恢复内质网的生理功能。通过构建GRP78基因过表达载体和GRP78 siRNA转染LS8细胞，观察LS8细胞自噬的变化。结果发现，内质网分子伴侣GRP78及其下游调控因子IRE1/TRAF2/JNK调控了氟诱导的成釉细胞发生自噬。自噬激活是对氟诱导的LS8细胞毒性的一种保护性反应，自噬的上调可阻止有害成分的积累，维持细胞内稳态并促进细胞存活。伴侣GRP78表达的变化在氟处理的LS8细胞的自噬中起着重要作用。结论：过量氟可以诱导成釉细胞发生内质网应激反应，内质网分子伴侣GRP78通过IRE1/TRAF2/JNK通路调控染氟LS8细胞自噬形成；调节ATG5和ATG7抑制自噬可以降低氟诱导的LS8细胞凋亡的发生。本研究明确了调控氟牙症发生的信号途径和蛋白分子，GRP78-IRE1-TRAF2-JNK信号转导途径对自噬的调控和影响，为氟牙症的预防提供新的理论和作用靶点。

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