分泌型S100A4介导维生素D-VEGF/VEGFR2信号通路在哮喘上皮屏障功能的作用

Airway epithelial barrier disruption is the primary process of asthma pathogenesis. VD (Vitamin D) exhibits protective effect in asthma by attenuating bronchial epithelial barrier dysfunction and airway inflammation. Our previous study revealed that 1,25(OH)2D3,the active form of Vitamin D, ameliorated airway epithelial hyperpermeability induced by House Dust Mite(HDM), the most general asthmatic allergen, and meanwhile inhibited the expression of epithelium-derived VEGF (vascular endothelial growth factor) and S100A4 (S100 calcium-binding protein A4). Moreover, we have found that VEGF mediated epithelial barrier dysfunction in asthmatic mice induced by HDM by phosphorylating VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Then whether S100A4 participates in HDM-induced airway epithelial barrier disruption? Our further research showed S100A4 inhibitor reduced the phosphorylation of VEGFR2. Hence, we hypothesizes extracellular S100A4 regulates VD-VEGF/VEGFR2 pathway and therefore resulted in asthmatic airway epithelial barrier dysfunction. This item will take advantage of in vivo and in vitro experiments, siRNA technology to confirm that extracelluar S100A4 promotes phosphorylation of VEGFR2 and that 1,25(OH)2D3 prevents airway epithelial barrier dysfunction by downregulating secretion of S100A4. This study will provide a new target for treatment of asthma.

气道上皮屏障破坏是哮喘发病的首要环节。活性维生素D(VD)可减轻哮喘屏障功能破坏及气道炎症。我们前期研究发现：活性维生素D（1,25(OH)2D3）可减轻哮喘常见致敏原屋尘螨（HDM）所致的气道上皮高通透性，并抑制气道上皮表达血管内皮生长因子（VEGF）、S100家族钙结合蛋白A4（S100A4），而VEGF促进血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的磷酸化直接参与哮喘小鼠气道上皮屏障破坏。那么S100A4是否参与HDM对气道上皮屏障的破坏？进一步研究显示：S100A4抑制剂可减少VEGFR2的磷酸化。因此我们假设：分泌型S100A4参与调控VD-VEGF/VEGFR2信号通路破坏哮喘气道上皮屏障。本项目拟采用体内外研究、siRNA技术证实此假说，通过证明分泌型S100A4促进VEGFR2的磷酸化，而1,25(OH)2D3下调S100A4分泌保护气道上皮屏障，为哮喘防治提供新的理论依据。

鉴于我国持续增长的哮喘患病率以及控制欠佳，哮喘防治日益重要。气道上皮屏障破坏是哮喘发病环节的首要环节。屏障结构蛋白不仅发挥防御功能，更扮演着上游信号分子的作用。维生素D（VD）抑制VEGF（血管内皮生长因子）释放进而减少VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）的磷酸化，在炎症中发挥保护作用。S100A4则引起下游VEGF释放增加及VEGFR2磷酸化，诱发并加重哮喘。.基于我们的前期研究，本项目采用1,25(OH)2D3预处理、S100A4抑制剂niclosamide灌胃预处理、分泌型S100A4多克隆抗体滴鼻预处理后检测HDM诱导的哮喘小鼠在S100A4、VEGF-A、VEGFR2/p-VEGFR2及屏障蛋白的变化，并通过病理、免疫组化、炎症因子的ELISA变化来探索此信号通路；体外研究采用外源性补充1,25(OH)2D3、niclosamide、分泌型S100A4多克隆中和抗体、rhS100A4、VEGF中和抗体贝伐珠单抗处理16HBE细胞及干扰S100A4的16HBE细胞，检测其屏障功能及S100A4、VEGF、VEGFR2/p-VEGFR2、屏障蛋白的变化来证明分泌型S100A4在气道上皮屏障功能方面的作用。.结果显示：分泌型S100A4在参与哮喘发病及气道上皮屏障破坏，S100A4促进VEGF-A释放和VEGFR2磷酸化。中和胞外的S100A4也能发挥抑制胞内S100A4相类似的效果。同时，使用HDM刺激或过表达S100A4均能引起VEGF-A/VEGFR2激活，而敲除VEGFR2可以减轻rhS100A4及HDM引起的屏障功能及蛋白的破坏，而不减少VEGF-A的表达。我们也在临床研究中发现肺泡灌洗液中S100A4水平增高，S100A4水平与淋巴细胞、嗜酸性粒细胞百分比、IgE呈正相关，与FEV1、FEV1%pred和FVC呈负相关。而血清中S100A4则增高不明显，肺泡灌洗液S100A4水平与疾病严重程度相关。.本项目证实了哮喘小鼠肺泡灌洗液、体外细胞培养液及哮喘患者肺泡灌洗液S100A4水平升高，动物实验中S100A4促进VEGFA/VEGFR2信号通路激活，引起哮喘气道屏障功能破坏，S100A4尤其是分泌型S100A4参与到哮喘的发病机制当中。哮喘患者肺泡灌洗液S100A4水平与疾病严重程度相关，中和细胞外S100A4可能是未来可行的哮喘治疗策略之一。

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