利用禽双链RNA病毒感染瞬间的细胞转录组测序挖掘协助或抵抗病毒进入的基因表达调控网络

A lot of study focus on the interaction between virus and host cells, but comprehensive global gene expression analysis of cells upon attachment of virus on cell membrane is till lack. Our study will foucus on the transcriptome of cells upon attachment of non-enveloped virus IBDV or enveloped virus IAV on cell membrane when the endocytosis is inhibited. It’s worth to expect that change of global expression profiles of cells in response to attachment of virus will be unveiled. From the data we may find the candidate signal pathways or genes benefit or harmful for infection at first stage of virus invading, which may provide new potential opportunities for therapeutic intervention in interfering the attachment and entry of virus.

目前已有许多研究关注病毒与宿主细胞的互作，但病毒如何在接触细胞膜过程中影响细胞内的信号通路和代谢途径未见有系统的研究。本研究拟以不带囊膜的禽双链RNA病毒和带囊膜的低致病性禽流感病毒IAV为模型，利用RNA-Seq技术检测IBDV和IAV结合细胞膜时对细胞基因表达，基因产生，蛋白质编码，异常转录本产生和融合基因出现变化的情况，分析在细胞内吞作用阻断的而抑制病毒进入细胞的情况下病毒对细胞基因转录的影响，以了解病毒接触细胞时是否激活了细胞的抗病毒反应或者通过信号传递引发有利于病毒侵入或复制的变化，以及囊膜病毒和非囊魔病毒在这一过程中的异同。上述研究所发现新的候选基因以及信号通路可以为开发用于阻断病毒结合和侵入细胞的抗病毒药物提供新的研发思路和直接的药物靶标。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是近年来受到广泛关注的区别于传统线性RNA的一类特殊的内源性RNA分子，具有调控基因表达的作用。流感病毒是危害人类健康重要病原之一，其中A型流感病毒流行范围最广、危害程度也最大。自噬是一种保守的，对细胞内物质进行周转的重要过程，在维持组织内稳态以及病原体清除的过程中发挥着重要作用。近年来对细胞自噬的研究成为大家关注的热点，而目前还未见有关circRNA与细胞自噬之间关系的研究。因此，本实验以H1N1流感病毒感染A549细胞为模型，通过高通量测序，初步分析了环状RNA对流感病毒复制的影响，并对环状RNA是否通过细胞自噬途径影响流感病毒复制的机制进行研究。.通过对H1N1流感病毒感染A549细胞中的RNA进行高通量测序，筛选出6种H1N1流感病毒感染A549细胞后显著上调表达的circRNAs。选择上调表达最显著的环状GATAD2A作为研究对象，探讨其对H1N1流感病毒复制的影响。.首先构建了过表达环状GATAD2A的细胞系和敲低环状GATAD2A的细胞系。用H1N1流感病毒分别感染环状GATAD2A过表达和敲低细胞系，结果发现，过表达环状GATAD2A能够促进H1N1流感病毒复制，而环状GATAD2A敲降后则抑制H1N1流感病毒复制。.通过western blotting实验发现，过表达环状GATAD2A能够显著抑制LC3 I型向II型的转化，并促进自噬底物P62的大量累积，即环状GATAD2A能够抑制细胞自噬的发生。VPS34在细胞自噬的起始阶段发挥重要作用，VPS34敲除细胞系中的自噬水平受到抑制。在VPS34细胞系中过表达环状GATAD2A，结果发环状GATAD2A在VPS34敲除细胞中不引起LC3-I型向LC3-II的转化，但能够显著抑制P62的降解。而H1N1流感病毒感染A549-KO-VPS34细胞系后，H1N1流感病毒的复制水平相比对照组明显升高。因此，抑制细胞自噬能够促进H1N1流感病毒的复制。.综上所述，过表达环状GATAD2A能够通过细胞自噬影响H1N1病毒复制。环状GATAD2A促进H1N1流感病毒的复制，并且抑制细胞自噬的发生，而抑制细胞自噬有利于H1N1流感病毒的复制。本课题首次对环状RNA影响H1N1流感病毒复制机制进行了初步探究。

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