微孢子虫感染诱导的家蚕细胞凋亡抑制及其Serpins在抑制过程中的作用

Microsporidia are obligately intracellular and unicellular parasites that classified into Fungi, they cause different infections in invertebrates(insects, nematodes) and vertebrates(human, fish). Infections of microsporidia cause the inhibition of apoptosis of host cell, however the mechanism is still unknown, and also no gene of parasites was reported to participate in the inhibition process. Poxvirus Serpins behave important roles in inhibiting apoptosis of host cells. Fortunately, we characterized a dozen of serpins(NbSPNs) in Nosema bombycis, 10 of them with predicted signal peptides. Phylogeny analysis shows that these serpins clustered together with serpins of poxvirus. NbSPNs could be sorted into yeast mitochondria when expressed in Saccharomyces cerevisae. And the NbSPN13 purified from eukaryote expression has the activity of inhibiting the trypsin. Two NbSPNs transgenic silkworm cell lines both have a trait of quicker increase of cell number than that of control. All these results suggest that NbSPN may participate in apoptosis regulation of host cells as Serpins of poxvirus. So on the basis of results of the last NSFC project, we aim to discover the mechanisms of apoptosis inhibition of silkworm cells induced by the N. bombycis, and to probe the NbSPNs function in regulating the apoptosis of host cell, which is significant for elucidating the pathogenesis of microsporidiosis.

微孢子虫是一种单细胞、专性细胞内寄生的真菌，可以感染昆虫、线虫等无脊椎动物和人、鱼等脊椎动物。微孢子虫的侵染可以抑制宿主细胞的凋亡，但其抑制凋亡的分子机制还不完全清楚；微孢子虫的哪些基因参与了对凋亡的调控，还未见报道。研究发现痘病毒的丝氨酸蛋白酶抑制物（Serpins）主要参与对宿主细胞凋亡的抑制。有趣的是，我们在家蚕微孢子虫中也发现一簇Serpins（NbSPNs），多数为分泌型，进化分析表明其与痘病毒的Serpin有较近的聚类；其中NbSPN13具有蛋白酶抑制活性，并发现在酿酒酵母中其可以被分选进入线粒体；构建的两株NbSPNs转基因家蚕细胞系具有细胞数目增加较快的特征。我们推测NbSPNs可能参与对宿主细胞凋亡的调控。本课题以上一基金项目结果为基础，旨在阐明微孢子虫诱导家蚕细胞凋亡抑制的分子机制以及NbSPNs在凋亡通路调控中所发挥的作用，这对揭示微孢子虫致病机理具有重要意义。

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物，可以感染昆虫、虾、鱼、兔以及人类，严重危害农业和人类健康。家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）是人类发现的第一种微孢子虫，主要寄主经济昆虫家蚕。胞内病原感染会通过各种机制调控宿主细胞凋亡，为自身增殖提供有利的胞内环境，已有报到微孢子虫可抑制宿主细胞凋亡，但其抑制的分子机制还未阐明。我们前期在N. bombycis中发现一大簇微粒子属特异的丝氨酸蛋白酶抑制物（Serpin）编码基因，且多数为分泌型，推测其功能可能与细胞凋亡抑制有关。研究发现感染N. bombycis后家蚕中肠细胞凋亡被显著抑制；同时N. bombycis感染家蚕胚胎细胞系（BmE）也能抑制放线菌素D（Act D）诱导的细胞凋亡。在感染家蚕中肠及脂肪体组织中均发现Nbserpins有转录，通过IFA对Nbserpin在感染细胞中分泌定位特征分析，研究发现Nbserpin5、Nbserpin14能定位到宿主细胞核中，而Nbserpin1、Nbserpin8和Nbserpin9定位到宿主细胞细胞质中，表明Nbserpin在病原与宿主互作中具有重要作用。进一步分析发现Nbserpin14转基因细胞能够抑制Act D诱导的细胞凋亡。分析发现，Nbserpin14活性区域P1位点与痘病毒Serpin蛋白CrmA相同，推测Nbserpin14能够抑制家蚕凋亡通路中与Caspase 3同源的半胱氨酸蛋白酶BmICE活性，从而抑制宿主细胞凋亡。实验发现在感染细胞中BmICE活性被抑制，通过RNA干扰Nbserpin14表达后，BmICE活性升高；通过IFA及Co-IP发现Nbserpin14与BmICE存在相互作用。综上，本研究证实了微孢子虫通过分泌Nbserpin14到宿主细胞中抑制BmICE的活性而抑制宿主细胞凋亡。本研究对阐明微孢子虫的致病机理有重要的科学价值。本项目已经发表论文5篇，申报专利4项，授权2项，获得教育部自然科学二等奖1项，主办国际学术会议一场，参加国际学术会议二次，培养研究生11人，已毕业9人；部分重要研究成果还在整理投稿中。项目组将继续对微孢子虫Serpin抑制宿主细胞凋亡的分子机制进行深入研究，继续分析其它分泌型Serpins是否与NbSerpin14存在协同作用，期望本研究能继续得到国家自然科学基金的支持。

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