基于尿多形红细胞miRNA及蛋白分析建立IgA肾病无创诊断新的生物标记物

血尿是我国最常见肾脏病-IgA肾病的主要表现。尽管尿多形红细胞是肾小球疾病的证据之一，但尿多形红细胞的性质与具体肾脏病的关联尚无定论。研究证实红细胞中存在丰富的miRNA，我们发现尿红细胞miRNA在不同肾脏病中存在差异。本研究利用流式细胞仪分选不同病理表现IgA肾病的尿多形红细胞；检测尿红细胞中与肾脏致病关系密切的miRNA的表达，筛选出疾病候选标志物；利用激光微分离技术，研究尿红细胞miRNA与不同病理表现IgA肾病肾小球miRNA表达的相关性；通过细胞共孵育明确系膜病变对尿红细胞miRNA表达的影响；结合生物信息学技术确定候选miRNA的靶基因；分析尿红细胞膜蛋白成分及氧化异常，明确尿多形红细胞的异常结构基础，通过免疫电镜等进行验证。进而建立尿红细胞miRNA与尿已知标志物的关系。研究将通过尿miRNA和蛋白分析建立IgA肾病临床与病理评估的新的生物标志物，并通过病例随访进行验证。

血尿是我国最常见肾脏病-IgA肾病的主要表现。尽管尿多形红细胞是肾小球疾病的证据之一，但尿多形红细胞的性质及内容物与具体肾脏病的关联尚无定论。本课题利用已经建立的IgA肾病协作网的工作平台，已留取了来自北京市多中心的IgA肾病患者血清及尿液标本近1000份，为开展多中心、大样本的生物标志物的验证工作提供了条件。通过对国内外现有IgA肾病生物标志物的挖掘与整合，我们验证了差异性尿沉渣miRNAs标志物和尿液蛋白质标志物。这些标志物不仅与尿蛋白、eGFR等临床指标相关，也能反映肾小球、肾小管及肾间质的病理损伤特点及程度。联合尿miRNAs与蛋白尿等多个标志物可以提高病情评估的准确性。尿液标志物的基线水平可以预测IgAN病变进展以及对临床治疗的反应性，成为潜在的IgAN无创标志物。本课题还建立了简单高效的CD235a免疫磁珠和流式细胞仪分选尿红细胞的技术，为今后进一步深入研究尿红细胞打下了基础。此外，利用流式细胞仪结合CD235a免疫磁珠分选出不同肾病来源、不同形态的尿红细胞，找到了3个主要来源于红细胞的IgA肾病尿液miRNAs标志物，对于无创诊断IgA肾病具有较高的敏感性和特异性，其中ROC曲线显示miR-486-5p AUC面积最大，达0.935。而联合上述三个指标AUC值则增加至0.940。这一发现使无创诊断IgA肾病成为了可能，也为继续寻找新的无创生物标志物开拓了一条全新的道路。本课题还利用蛋白质高通量芯片结合ELISA技术，找到了新的尿上清蛋白标志物angiostatin，其在IgAN组水平显著高于NC组但低于MN组和MCD组，与临床病理进行相关性分析发现angiostatin水平与SCr（r=0.939）、BUN（r=0.931）、Cys C（r=0.923）、U-Prot水平（r=0.784）、全球硬化比例（r=0.718）、新月体比例（r=0.588）均呈显著正相关，与eGFR（r=-0.721）呈显著负相关。本课题还发现尿红细胞miRNAs表达量的升高与血红细胞差异无关，而与红细胞经过IgA肾病病变肾单位后的改变相关，而尿多形红细胞分泌含miRNAs的囊泡可能是尿红细胞的干预IgA肾病的重要机制。这有可能解开目前争论不休的尿红细胞干预肾脏疾病预后的谜团。

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