嗜热古细菌麦芽糖基淀粉酶催化异黄酮转糖基化反应机理的研究

异黄酮具有缓解妇女更年期综合症、增强骨密度、降低癌症发生率等多种生物活性，但是它的水溶性较低，限制了其在食品药品中的应用。本课题前期构建基因工程菌，过量表达了嗜热古细菌Thermofilum pendens和Staphylothermus marinus的麦芽糖基淀粉酶TfMA和SMMA。初步证实：TfMA可以催化转糖基化反应，合成高水溶性异黄酮；而SMMA不能催化异黄酮转糖基化反应。本课题拟进一步通过基因定点突变，改变TfMA和SMMA的保守区氨基酸，分析野生酶和突变酶的分子结构及对不同种类异黄酮的转糖基化活性，测定转糖基化异黄酮的结构，并与细菌麦芽糖基淀粉酶比较，以阐明古细菌麦芽糖基淀粉酶催化异黄酮转糖基化的反应机理。

异黄酮类化合物具有缓解妇女更年期综合症等多种生物活性；然而它的水溶性差，限制了其在食品、药品中的应用。本项研究使用具有较高最适催化反应温度的、嗜热古细菌麦芽糖淀粉酶TfMA和SMMA，合成高水溶性异黄酮，并阐明反应机制。首次发现TfMA能够催化-C-C-糖苷类型异黄酮的转糖基化反应。以10 mg/mL葛根素为糖基受体，100 mg/mL β-环糊精为糖基供体，加入TfMA，在90℃进行1hr的转糖基化反应，发现至少形成了7种联结不同数目葡萄糖残基的葛根素衍生物。为了调查决定嗜热古细菌麦芽糖淀粉酶TfMA和SMMA活性的关键氨基酸、阐明对-C-O-C- 糖苷类型异黄酮的糖基化方式，本项研究采用基因定点突变技术，将SMMA和TfMA第二保守区氨基酸的最后一个氨基酸由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)，分别得到二个对γ-CD的水解活性显著下降的突变体SMMA－G446E 和TfMA－G407E。采用高效液相色谱电喷雾质谱联机检测技术，分析了上述4种麦芽糖淀粉酶，在相同水解活力的条件下，在90℃催化β或γ－环糊精与1mg/mL染料木苷转糖基化反应以后，所形成多糖基化染料木素。在TfMA催化的反应中，主产物为葡萄糖基α染料木苷和麦芽二糖基α染料木苷；在SMMA催化的反应中，主产物为葡萄糖基α染料木苷；并且，二种反应中葡萄糖基α染料木苷的保留时间也不同，说明形成了不同的α葡萄糖苷键；短的葡萄糖基α染料木苷，主要存在于TfMA催化的反应中，具有相对较高的极性（水溶性）。二个突变型SMMA－G446E 和TfMA－G407E，相对于野生型SMMA和TfMA，合成多糖基化染料木素的能力显著下降、但组成没有变化。以上结果说明：SMMA和TfMA第二保守区氨基酸的最后一个氨基酸－—甘氨酸，对于古细菌麦芽糖淀粉酶的水解活性和转糖基化活性是至关重要的。结晶结构显示它位于酶空间结构的一个“口袋(pocket)”底部，构成一个“结合额外糖分子的空间（the extra sugar-binding space）”，在形成异黄酮转糖化产物中，它起着结合糖基受体异黄酮的作用。由于异黄酮具有很强的疏水性，而甘氨酸的亲水性比谷氨酸的亲水性小，推测甘氨酸较谷氨酸易于结合异黄酮；所以定点突变甘氨酸为谷氨酸以后，SMMA和TfMA对异黄酮的转糖基化能力下降。

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