黄芩抑制多重耐药金黄色葡萄球菌及其调节RsbU/MgrA去磷酸化通路、NorA表达的研究

Staphylococcus aureus(SA) is one of the most important pathogens that causes infectious diseases in the skin. Multidug-Resistance(MDR) due to efflux pump is the most common reasons for the treatment failure. NorA, which pumps quinolones out of the cell, is responsible for the resistance to hydrophilic quinolones in SA. MgrA, which is a global regulator in SA that controls the expression of MDR ef?ux transporters, is the main regulator of NorA. RsbU, which encodes a Ser/Thr phosphates, is able to dephosphorylate MgrA-phosphorylation(MgrA-P).Thus, the pathway of RsbU/ MgrA-P/NorA is important for regulating transcription of NorA. Huangqin could reverse the resistance to quinolones in SA. The initial mechanism remain unknown. Based on the former research findings, we raise the hypothesis that Huangqin could dephosphrylate RsbU and MgrA, then reduce the transcription of NorA, which accounts for the mechanism of MDR reverse. We will sucolone NorA，MgrA and RsbU to the plasmids and then electrotransfect to wild sensitive SA respectively. We will detect the MIC of Huangqin for constructed NorA+-SA colony. The constructed NorA+-SA, MgrA+-SA and RsbU+-SA colony will be cultured in Huangqin solution respectively. RT-PCR will be carried out to detect MgrA mRNA and NorA mRNA respectively. Western blot will be carried out to detect the phosphorylation of RsbU and Mgra respectively. The research will provide a new target for treating multidrug-resistance SA.

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是引起感染性皮肤病的重要致病菌之一。近年来，由主动外排基因导致的多重耐药日益突出，是导致临床失败的主要原因之一。NorA是介导SA对亲水性喹诺酮类药物耐药的主要机制，RsbU去磷酸化/MgrA去磷酸化/NorA表达通路是SA调控NorA表达的重要途径。有研究表明黄芩水提液可逆转耐喹诺酮类药物SA的耐药，但具体机制国内外未见报道。在前期研究的基础上，我们提出"黄芩可通过调节RsbU去磷酸化/MgrA去磷酸化/NorA通路进而逆转耐药"假说，分别构建耐药菌株、RsbU+-SA株和MgrA+- SA株，采用微量肉汤法、Western blot和RT-PCR等方法研究黄芩对耐药株的耐药逆转、对NorA、MgrA表达抑制以及对RsbU去磷酸化/MgrA去磷酸化/NorA的调节作用。该研究将为治疗多重耐药SA提供新的靶点。

目的：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是引起感染性皮肤病的重要致病菌之一。近年来，由主动外排基因导致的多重耐药日益突出，且生物膜形成是引起耐药的重要原因，是导致临床失败的主要原因之一。NorA是介导SA对亲水性喹诺酮类药物耐药的主要机制，MgrA去磷酸化/NorA表达通路是SA调控NorA表达的重要途径。有研究表明黄芩水提液可逆转耐喹诺酮类药物SA的耐药，但具体机制国内外未见报道。在前期研究的基础上，我们提出“小檗碱可通过调节RsbU/MgrA/NorA通路进而逆转耐药”假说，试图进一步明确小檗碱抑制耐药SA的可能机制。方法：采用微量肉汤稀释法检测小檗碱对多种耐药株的抑制作用，并在透射电镜下观察小檗碱作用于SA后的形态学变化。构建SA生物膜模型，扫描电镜下观察不同浓度的小檗碱溶液对生物膜形成的抑制作用。构建稳定表达NorA的耐药株是本研究的关键。利用单拷贝质粒PLL39和PLL2787构建携带NorA的RN4200菌株。利用多拷贝质粒PYJ335连接NorA，筛选转化后电转入RN4200，再经phage85感染到ATCC25923（PYY-25923）。采用微量肉汤稀释法检测小檗碱对PYJ-25923的抑制作用、RT-PCR检测小檗碱对MgrA及NorA表达的调控作用。结果：小檗碱对耐药株MIC值在64-128g/ml，MIC浓度小檗碱在可显著抑制耐药株的生长，电镜下显示经MIC浓度小檗碱作用后，耐药株和ATCC株染色体与细胞质被溶解破坏，且可抑制耐药株生物膜的形成。单拷贝质粒PLL39构建的菌株对喹诺酮类药物的MIC值没有发生变化，而多拷贝质粒PYY35构建的PYY-ATCC25923对环丙沙星的MIC值增高，提示多拷贝质粒载体更适于构建NorA耐药株。小檗碱可抑制PYJ-ATCC25923 MgrA和NorA的转录，提示小檗碱通过抑制MgrA的表达而抑制NorA表达，进而达到抑制耐药株的作用。结论：本研究采用多拷贝质粒成功构建稳定表达NorA的耐药株 ，本质粒载体系统的建立将为SA的相关研究打下良好的基础。同时，研究证实小檗碱对SA多种耐药株有良好的抑制作用，其通过抑制MgrA介导NorA表达而抑制耐喹诺酮SA。且可抑制多重耐药SA生物膜的形成。

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