非天然蛋白质高效合成的非天然碱基正交系统编码机制研究

Synthesis of unnatural proteins with new structures and functions by the incorporation of unnatural amino acids (unAAs) is an important developing direction of modern protein engineering. It offers great opportunities to design and synthesize novel biopharmaceuticals, biocatalysts, and biomaterials. Three mostly studied unAA incorporation approaches are global suppression, stop codon suppression and frame-shift codon. However, low orthogonality and difficult multiple-site incorporation limit their further development. To address these challenges, new orthogonal translation systems with unnatural bases have been developed. To achieve accurate and efficient translation, exploring the encoding mechanism of unnatural bases is the key scientific challenge that needs to be addressed. In this project, cell-free unnatural protein synthesis platform with the unnatural base translation system will be established, which could also serve as a robust and fast high-throughput testing platform. By using the reporter gene as the model system, we will construct a deep mutation pool with different unnatural codons, orthogonal tRNAs with different anti-codon loops, and different genetic sequences, and perform the analysis of the encoding efficiency. Based on a large amount of data, the relationship between the gene characteristics and the unAA incorporation efficiencies could be quantified. A rational design principle then could be built to guide the multiple-site unAA incorporation for highly efficient unnatural protein synthesis. The implementation of this project would be of great significance to the design of novel proteins and the exploration of unnatural life systems, which would be widely applied to the basic and applied disciplines.

通过非天然氨基酸嵌入合成具有新型结构和功能的非天然蛋白质，是现代蛋白质工程领域发展的重要方向，其可作为合成新型生物医药、生物催化剂和生物材料的基石。全局抑制、终止密码子抑制和移码密码子是三种研究较多的非天然氨基酸嵌入手段，但由于低的正交性或难以实现多位点嵌入等问题限制了它们的发展。为克服这些挑战，新的基于非天然碱基的正交编码体系被发展。为实现体系精准高效地编码翻译，非天然碱基编码机制的研究是亟需解决的关键科学问题。在本项目中，首先构建非天然碱基编码的无细胞非天然蛋白质合成及测试平台；然后基于荧光报告基因建立突变库，高通量测试不同非天然密码子、正交tRNA中反密码子环和基因特征对编码效率的影响；最后基于大量的数据进行序列-功能关系解析，建立理性设计原则指导蛋白质中多位点非天然氨基酸的高效嵌入。该项目的实施对于新型蛋白质的设计、非天然生命体系的探索等，具有非常重要的基础和应用科学研究价值。

将丰富多样化的非天然氨基酸嵌入蛋白质，设计与合成新型结构和功能的非天然蛋白质，是蛋白质工程领域的前沿方向，对于促进生命科学、生物医药、生物催化等国家重大需求发展领域具有重要的基础和应用研究意义。然而如何发展独立于天然体系的非天然编码翻译正交体系，是高效、精准、稳定地将多种类非天然氨基酸多位点嵌入蛋白质的必经之路，也是该研究领域拟解决的关键科学和技术问题。首先，我们通过设计基因模板、转录模块和翻译模块，发展适配于非天然蛋白质合成的无细胞生物合成体系，将其发展成为兼具测试表征和高效表达的蛋白质合成平台。进一步采取前沿限域调控策略，融合先进无机和有机材料实现基因模板和酶的有序调控，提升蛋白质合成能力；并借助光控、温控、磁控等物理响应策略手段实现无细胞体系转录和翻译过程的时空控制。在无细胞蛋白质平台建立的基础上，遵循生物学中心法则，发展非天然编码正交翻译体系，设计最佳的非天然编码元件，包括正交DNA模板、正交mRNA、正交tRNA和正交氨酰tRNA合成酶等，并探索核糖体、延伸因子、释放因子等对非天然氨基酸嵌入的影响作用。最后，以非天然功能蛋白质合成为目标，系统性的探究影响非天然氨基酸嵌入的影响因素，研究序列-功能关系，总结规律并建立理性设计原则，实现不同非天然蛋白质合成中多种类多位点非天然氨基酸的高效且精准嵌入。该项目研究成果，不仅可用于生命探索、原型设计、人工细胞等前沿基础研究，还可以融合人工智能等前沿技术合成更复杂和新功能的人工从头设计蛋白质，拓展生物医药、生物催化、生物材料等领域的应用边界。

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