应用冷冻电镜原位断层成像技术解析细胞骨架及相关GPCR蛋白结构

The neuronal cytoskeleton is extremely important for maintaining cell morphology, migration, material transportation. Owing to the rapid development of new technology, including the super-resolution fluorescence microscope and the application of cryo-electron microscope, researchers have observed the morphology of cytoskeleton in vivo. Importantly, they found that the actin formed ringlike structures that wrapped around the circumference of axons and were evenly spaced along axonal shafts with a periodicity of ~180 to 190 nanometers. What’s more, the periodic skeleton has an important role that it works as a platform for membrane protein recruitment and related signal transduction. However, to date, due to the limitations of technology and the complexity of the system, there has no high-resolution information of the cytoskeleton and the surrounding membrane proteins that interacting with it. In this project, I mainly focus on the in situ structural determination of neuronal axonal cytoskeleton by cryo-electron tomography. During which, I will use the technology of super-resolution fluorescence microscopy and cryo-electron microscopy to develop the method of correlation of light and electron microscope (CLEM). Finally, I will try to reveal the molecular basis of cytoskeleton, which can interpret the regulation of neuronal plasticity and the molecular mechanisms of neural signaling.

神经元的细胞骨架具有十分重要的功能，包括维持细胞形态、迁移、物质运输等等。随着新技术的不断开发及发展，包括超分辨率荧光显微技术及电子显微镜技术的应用，研究者观察到了这类细胞骨架的存在，同时发现神经元轴突细胞骨架呈现周期性分布，更为重要的是，该分布方式是多条信号通路发挥正常生理功能的结构基础。然而，到目前为止，受制于现有研究方法的局限性以及该体系的复杂性，细胞骨架的高分辨率结构，以及细胞骨架与周围膜蛋白相互作用方式仍然缺失。本项目的主要研究内容是联合应用超分辨荧光显微技术及冷冻电子显微镜技术，建立冷冻电镜原位断层成像技术，解析神经元轴突中细胞骨架及相关膜蛋白的原位高分辨率结构，揭示细胞骨架的分子基础，为神经元的可塑性调控及神经信号通路的分子机制提供重要认知。

神经元的细胞骨架功能十分重要，包括维持细胞形态、迁移、物质运输等。随着新技术的不断开发及发展，包括超分辨率荧光显微及电子显微镜技术，研究者观察到了这类细胞骨架的存在，同时发现神经元轴突的细胞骨架呈现周期性分布，更为重要的是，该分布方式是多条信号通路发挥正常生理功能的结构基础。但到目前为止，由于该体系的复杂性以及现有研究方法的局限性，细胞骨架的高分辨率结构，特别是原位的细胞骨架及其周围膜蛋白相互作用方式仍然缺失。.本文的主要研究内容是联合应用荧光显微技术及冷冻电子显微镜技术，结合冷冻电镜原位断层成像技术，解析神经元轴突中细胞骨架的原位结构。已取得的进展包括：第一，成功在玻璃片以及冷冻电镜载网上培养原代大鼠胚胎神经元，并利用超分辨荧光显微技术观察到了活细胞中轴突的肌动蛋白骨架的周期性分布；第二，尝试光镜-电镜联用技术，在冷冻条件下，荧光共定位标识周期性的肌动蛋白，应用冷冻电镜收取到了高质量的原位断层成像数据；第三，利用多种断层成像重构技术软件重构获得了高质量的三维体，根据重构出的较高质量三维图像，能够分辨出多种细胞骨架以及囊泡、溶酶体、线粒体、核糖体等细胞器及蛋白；第四，利用子断层平均技术解析轴突中的微管结构，获得了较低分辨率的结构模型，同时观察到纤维管中的蛋白，为后续精细分析提供了基础；第五，试验了活细胞标记方法，为原位电镜标记提供了重要思路。

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