间脑星形胶质细胞发生的谱系追踪和转录调控机制

As the most abundant glial cells in the central nervous system, one of the important characteristics of astrocytes is heterogeneity in different regions, and the study of astrogenesis in different brain regions is an important basis for understanding the pathogenesis of neurodevelopmental related diseases. Previous study of astrogenesis mainly focused on the two anatomical locations, the telencephalon and spinal cord. However, it is completely unclear that how the astrocytes in the diencephalon originate and develop. Our preliminary experimental results indicate that the third ventricle zone of mouse embryonic radial glial cells (RGCs) is the source of diencephalic astrocytes, and the dorsal and ventral RGCs of the third ventricle have regional specificity. By using in vivo electroporation of embryo in the third ventricle of the diencephalon and genetic mouse model, we will lineage trace the migration, differentiation and fate of RGCs in the third ventricle region at different developmental stages. By using astrocyte-specific transgenic mouse model, we will propose further genetic lineage mapping analysis of spatiotemporal pattern of astrogenesis. By using laser microdissection, flow cytometry and RNA-Seq analysis, we will study the mechanisms of transcriptional regulation underlying astrocytic fate determination and morphogenesis.

作为中枢神经系统中最丰富的一类胶质细胞，星形胶质细胞一个重要的特点是在不同区域具有异质性，研究不同脑区星形胶质细胞的发生是了解神经发育相关疾病发病机制的重要基础。以往对于星形胶质细胞发生的研究主要集中在端脑和脊髓这两个解剖位置，对于间脑中星形胶质细胞是如何起源和发育的还完全不清楚。我们预实验结果表明小鼠胚胎期第三脑室区放射状胶质细胞（RGCs）是间脑星形胶质细胞的来源，而且第三脑室背侧和腹侧RGCs具备区域特异性。利用间脑第三脑室区胚胎电转、遗传小鼠模型等在体标记的手段，我们将谱系追踪第三脑室区RGCs在不同发育阶段的迁移、分化和命运转归；利用星形胶质细胞特异性转基因小鼠模型，进一步遗传谱系分析间脑星形胶质细胞发生的时空规律；利用激光显微切割、细胞流式分选以及RNA-Seq分析等手段，研究间脑星形胶质细胞命运决定和形态发生的转录调控机制。

星形胶质细胞是中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中最丰富的一类胶质细胞，广泛分布于CNS的各个区域。星形胶质细胞发生和功能紊乱与神经系统疾病如脑瘤、脑损伤、退行性疾病等密切相关。本课题首先利用小鼠间脑第三脑室区胚胎电转在体标记的手段，谱系追踪了第三脑室区放射状胶质细胞（Radial glial cells, RGCs）在间脑不同发育阶段的迁移、分化和命运转归。在E14.5小鼠胚胎电转CAG-EYFP质粒能够特异性标记第三脑室区的RGCs，我们发现第三脑室背侧和腹侧部位的RGCs具有完全不同的分化命运：在间脑背侧分化为GS阳性的星形胶质细胞，而在间脑腹侧分化为NeuN阳性的神经细胞。在E14.5小鼠第三脑室区胚胎电转hGFAP-EGFP质粒，我们发现表达EGFP的RGCs呈现放射状迁移模式，在间脑实质内迁移的前体细胞具备增殖的特征，并且表达早期星形胶质细胞的标志物，在P7和P14间脑EGFP阳性的星形胶质细胞60%以上与血管形成终足结构。其次，通过对转基因小鼠GFAP-CreERT2;Ai14在胚胎E14.5,E16.5和E18.5分别进行腹腔注射他莫西芬(tamoxifen)，检测报告基因tdTomato在小鼠出生后P14端脑和间脑的表达，并结合不同细胞类型的特异标志物进行染色，我们发现在间脑未定带区域首先出现tdTomato阳性的星形胶质细胞群。有意义的是，不同胚胎期tamoxifen诱导间脑表达tdTomato的细胞100%为S100β阳性的星形胶质细胞。最后，为了比较发育中的间脑和端脑的不同区域中控制星形胶质细胞发生的潜在机制，我们显微解剖了来自小鼠胚胎E14.5的背侧第三脑室壁（3V-d）、腹侧第三脑室壁（3V-v）和背侧侧脑室壁（LV-d）的脑组织，并进行RNA-seq分析，结果显示3V-d组上调的基因如Gbx2、Wif1、Slc17a6和Id3可能参与了调控背侧间脑中星形胶质细胞发生。另一方面，3V-d组中下调的基因，例如Sox3、Sy2、L1cam和Wnt7a，可能会促进腹侧间脑和皮层的神经发生。综上，这些结果阐明了间脑第三脑室区RGCs在发育不同阶段的谱系变化和命运转归，揭示了间脑星形胶质细胞的发育特征和调控机制。

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