古菌Sulfolobus tokodaii甘油醛脱氢酶及其对非磷酸化Entner-Doudoroff糖酵解代谢的调控机制

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
30900039
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
刘波
依托单位：
齐鲁工业大学
学科分类：
C0104.微生物遗传与生物合成
结题年份：
2012
批准年份：
2009
项目状态：
已结题
起止时间：
2010-01-01 至2012-12-31

项目参与者：
王存芳；孙锐；于帅；王会会；
关键词：
糖酵解甘油醛脱氢酶 tokodaii Sulfolobus 古细菌

项目摘要

古菌"中心代谢途径"-糖酵解具有独特的代谢路径并由许多特异性糖酵解酶催化。古菌中心代谢途径的研究，对于了解生命的起源、进化以及开发利用新的生物资源具有重要意义。研究表明，泉古菌Sulfolobus属利用Entner-Doudoroff（ED）途径进行糖酵解，其又可分为半磷酸化与非磷酸化的ED途径。然而,对于Sulfolobus属古细菌非磷酸化的ED途径中的一个关键酶-甘油醛脱氢酶,至尽仍不清楚。甘油醛脱氢酶催化古菌非磷酸化ED途径中三碳化合物转化过程的第一步反应-甘油醛氧化为甘油酸。本研究将首次从极端嗜热酸性古菌Sulfolobus tokodaii中克隆、表达可能参与该古菌非磷酸化ED途径的甘油醛脱氢酶基因，并从古菌细胞培养液中对甘油醛脱氢酶进行纯化，详细研究其底物特异性、催化特性、动力学等酶学性质，并揭示其在酶活性水平上对古菌非磷酸化ED糖酵解途径的调控机制。

结项摘要

本项目旨在鉴定参与极端嗜热酸性古菌Sulfolobus tokodaii非磷酸化Entner-Doudoroff葡萄糖酵解途径的甘油醛脱氢酶及其调节机制。为此，我们对古菌Sulfolobus tokodaii进行了培养，提取其基因组并克隆、表达与纯化可能的甘油醛脱氢酶（ST2484，ST0064，ST1116，ST2247）。我们对上述基因的酶学性质进行了研究，发现ST0064基因能催化乙醛、甘油醛、丙醛等一系列醛类底物的氧化，负责该古菌一系列醛类化合物的转化，被称为乙醛脱氢酶（stALDH）。研究发现，除乙醛外，该酶对D甘油醛以及DL甘油醛均具有较强的活性，其辅酶利用效率为NAD>NADP。酶蛋白具有很强的热稳定性，其活性可被氧化剂双氧水及硝化甘油（GTN）抑制，还原剂DTT、硫辛酸以及-巯基乙醇能够恢复被抑制的活性。此外，我们发现辅酶NAD以及NADP能够调节酶的热稳定性以及该酶的酯酶活性。进一步，我们对该蛋白质进行了分子建模，并通过结构模拟与序列分析鉴定了酶的关键催化残基E240与C274，以及酶与辅助因子NAD相互作用的关键氨基酸残基N142，K165，I168和E370。通过突变分析与生化功能验证，揭示了该酶与辅因子相互作用的分子机制。以上研究结果不但为开发高效、环保的工业用醛类化合物转化酶类提供了良好的素材，而且对于进一步研究乙醛脱氢酶这一生物体内重要的有机化合物转化酶类的催化机理以及进化机制具有重要意义。以上结果已发表于极端微生物领域权威杂志《Extremophiles》(影响因子2.941)。