家蚕Ng基因的精细定位及粘液腺分泌相关基因的筛选与鉴定

The insect eggs are fixed on the host plants or other materials that can protect eggs through secreting adhesive proteins to the egg surface. In this study, the normal silkworm and Ng mutant will be used as material. we will observe the morphological and ultrastructure changes of silkworm colleterial gland during development period, The transcriptome and proteome of normal and Ng mutant will be sequenced and identified. The differentially expressed genes are screened and identified by comparison of correlation analysis of transcriptome and proteome. Then cloning the related genes, then follow prokaryotic expression and antibody preparation. The expression pattern of the related genes will be definited by immunohistochemistry and fluorescence quantitative PCR. the relationship between the related genes and secretion function of silkworm colleterial gland will be analysed to clarify the molecular mechanism of secreting adhesive proteins.The result will provide references for revealing the silkworm colleterial gland development at the molecular level, which can explain the reproductive regulation mechanism of the related gene of insects colleterial. On these basis we will investigate a new target by using the colleterial gland and its related genes which can provide new ideas and methods for pest control.

昆虫在产卵时由其粘液腺分泌的胶着物质附着在卵的表面，将卵固定在寄主植物或产卵材料，可以对昆虫卵期生存及幼虫孵化起到保护作用。为研究家蚕粘液腺分泌功能及其机理，本研究以正常家蚕和产不胶着卵的粘液腺突变体（Ng）为材料，对Ng基因进行精细定位，测定正常家蚕及Ng突变体的粘液腺转录组、蛋白质组，通过对正常家蚕粘液腺及其Ng突变体粘液腺的转录组与蛋白质组比较关联分析，筛选、鉴定一些差异表达的基因；克隆相关差异基因、原核表达并制备抗体，采用免疫组织化学和荧光定量PCR，明确家蚕粘液腺相关差异基因的表达模式，分析这些基因与家蚕粘液腺发育及其分泌功能关系，阐明家蚕分泌胶着物质的分子机理，为从分子水平上揭示家蚕粘液腺的发育提供参考；解释家蚕粘液腺中特异表达的基因对昆虫的生殖调控机制，探讨以昆虫蚕粘液腺及其特异表达的基因作为害虫防治的新靶标，为对害虫的防治研究提供新思路、新方法。

蚕蛾的粘液腺可以分泌和贮存粘性物质，在雌蛾产卵时，粘液腺分泌的粘性物质会附着在卵的表面，使蚕卵对产卵材料具有较强的附着力，可以对蚕卵起到固定和保护的作用，也能够避免蚕卵散落在地面被敌害毁坏。本研究以家蚕野生型的粘液腺及其粘液腺突变体（Ng）为材料，利用混池测序（BSA）技术对Ng基因的分子定位，利用高通量测序技术进行转录组分析，利用TMT标记定量蛋白质组学技术进行质谱蛋白全谱分析，并进一步开展粘液腺蛋白质组与转录组比较关联分析。BSA分子定位分析表明表皮生长因子（EGF）/表皮生长因子受体（EGFR）通路、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白（Serpin）等富集显著；比较转录组分析表明ECM-receptor interaction、Sphingolipid metabolism和Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 三个Pathway中差异表达基因基因的富集水平较高较显著；比较转录组、蛋白质组及其关联分析确定可能与粘液腺粘液合成和分泌相关的候选基因分别是：家蚕半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（GALT）、家蚕N-乙酰神经氨酸裂合酶（NANA-Lyase）、家蚕半乳糖激酶样同亚型X2（GALK-LX2）和家蚕6-磷酸果糖谷氨酰胺氨基转移酶1-异构化酶（GFPT1-Like）。分别克隆EGR, EGFR, GlcNAcases, Serpin-28, GALT, NANA-Lyase, GALK-LX2, GFPT1-Like等差异基因，采用荧光定量PCR分析家蚕粘液腺差异基因的转录水平表达情况，原核表达并制备了多克隆抗体抗体，采用westernblot, RNAi技术，确定家蚕粘液腺相关差异基因的表达模式和功能。本研究为探明家蚕粘液腺在短时间内快速合成和分泌粘性物质的分子机制提供基础，有助于其他生物的组织器官的内分泌机制的研究，也可以为保护益虫和防治害虫提供新思路。

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