高粱RAP2基因在细胞壁合成中的功能研究和机制探索

The development of bioethonal from cellulose, which will not threaten food supplies, is significant for bioenergy production. In order to achieve cost-effective conversion, the feedstock quality needs to be genetically improved, particularly reducing lignin concentration and increasing cellulose content. Sorghum (Sorghum bicolor L.), with higher photosynthesis efficiency and biomass yield, abundant germplasms and excellent tolerance to drought and salinity, has been recommended as one of the most competitive bioenergy crops. Moreover, the sorghum genome is smaller and has been sequenced. Brown midrib (bmr) mutant sorghums with reduced lignin content showed a high potential for the improvement of bioethanol conversion efficiency. Suppression subtractive hybridization (SSH) combined with cDNA microarray profiling was performed to identify the differentially expressed genes in sorghum bmr mutants and a total of 153 differentially expressed genes were identified. Among the differentially expressed genes, a transcription factor gene SbRAP might be involved in lignin synthesis regulation. For validating the function of SbRAP in lignin synthesis regulation, we will overexpress and RNAi knock-out SbRAP in Arabidopsis and sorghum respectively, and detect their lignin and cellulose content. The influence of SbRAP to the structure and growth of the transgenic plants will also be observed. The proteins interacted with SbRAP will be screened through yeast-two hybridization and the down stream target genes of SbRAP will also be exploited. This work will provide new resources for genetic improvement of lignocellulosic biomass with improved bioethanol production and technical support for energy sorghum improvement.

发展纤维素乙醇工程，不影响粮油食品安全，对生物能源产业意义重大。低木质素、高纤维素原料可提高纤维素酶的降解效率，降低生产成本，是该技术产业化的基础。高粱光合效率高，耐盐碱，生物量大，基因组较小且测序已经完成，有丰富的资源，是很有潜力的能源作物。黄中脉突变体（brown midrib,bmr）茎叶木质素含量明显降低，是研究细胞壁木质素合成代谢的良好材料。前期通过抑制性差减文库和基因芯片技术试验，发现高粱bmr突变体与对照有153个基因差异表达，从中筛选出与木质素合成调控的相关转录因子SbRAP。本研究拟构建过表达和RNAi载体，转化拟南芥和高粱，检验转化体细胞壁中木质素和纤维素的含量和对其结构及生长发育的影响，验证目标基因的功能；同时通过酵母双杂交等技术识别其相互作用蛋白，研究其控制的下游靶基因及其可能的作用机理，为利用基因工程和分子标记辅助育种方法培育优质高产的能源高粱提供技术支撑。

全球正遭遇着越来越严重的能源危机。生物乙醇作为唯一一种能以液态形式存在的新能源，是我国现阶段最有可能实现产业化生产的主要生物能源产品之一。以粮食和油料作物为原料来生产乙醇可能会威胁国家粮油食品安全，而植物纤维素则是一种非常有潜力、前景广阔的生物乙醇的生产原料。高粱光合效率高，耐盐碱，生物量大，基因组较小且测序已经完成，有丰富的资源，是很有潜力的能源作物。黄中脉突变体（brown midrib, bmr）茎叶木质素含量明显降低，是研究细胞壁木质素合成代谢的良好材料。 对于高粱黄中脉突变体的研究有利于从分子机理上了解木质素代谢的调控，为进一步通过基因工程改良能源高粱创造条件。前期通过抑制性差减文库和基因芯片技术试验，发现高粱bmr 突变体与对照有153 个基因差异表达，根据基因的表达模式，从中筛选与木质素合成及调控相关的转录因子SbRAP。SbRAP在多个黄中脉高粱突变体中的表达明显低于野生型。本研究构建SbRAP过表达载体，转化拟南芥和高粱，但是只获得了转基因拟南芥。对于高粱的转化，我们使用的生长点转化法，未获得转基因高粱。通过检测转基因拟南芥的茎中木质素含量，我们发现过表达拟南芥中的木质素含量明显低于野生型拟南芥；同时，我们对8周大的拟南芥茎进行了切片并染色观察，转基因拟南芥中细胞壁中的木质素明显少于野生型。此外，我们还检测了转基因拟南芥中相关Marker gene的表达，从RNA水平证明了，SbRAP过表达拟南芥中木质素含量收到了抑制。SbRAP基因具有转录激活活性，并且转录激活活性主要依赖于基因的C端。这些实验结果证明，SbRAP基因抑制了拟南芥中的木质素的合成，是木质素合成途径中的重要的抑制性转录因子，这将为高粱及其它能源植物细胞壁成分的改良，培育低木质素的新种类提供了有益的线索。我们还进一步的对于SbRAP的下游互作蛋白进行了研究，前期使用的Pull-down技术，实验未获得阳性结果。为此我们已经改用酵母双杂交系统，有针对性的研究部分候选基因与SbRAP间是否存在互作现象，目前实验正在进行。我们还进一步的对于SbRAP的下游互作蛋白进行了研究，前期使用的Pull-down技术，实验未获得阳性结果。为此我们已经改用酵母双杂交系统，有针对性的研究部分候选基因与SbRAP间是否存在互作现象，目前实验正在进行。

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