先天性黑矇症Nmnat1小鼠动物模型的建立及其发病机理与表型逆转干预的研究

Leber congenital amaurosis (LCA), the most common cause of inherited blindness in childhood, is a severe retinal dystrophy that manifests as low vision and nystagmus at birth, or during infancy. Leading an international team of 5-countries in 2012, the grant applicant successfully identified NMNAT1 as the disease gene of type 9 LCA using exome sequencing. The discovery was published at Nature Genetics. This study aims to create LCA-Nmnat1 knock-in mice by TALEN strategy to study the pathologic mechanism of NMNAT1 in LCA at the molecular, cellular, tissue and individual levels. The therapeutic effects of NAD+ supplement and AAV-mediated gene therapy will be explored.

先天性黑蒙症（LCA）是常见、早发、严重的遗传性视网膜病变，患儿出生时或一年内双眼视功能完全丧失。2012年申请人领衔与5国研究小组合作，运用外显子组捕获和新一代高通量测序法，成功发现NMNAT1基因突变可导致第9型LCA，论文发表在Nature Genetics。本研究拟迅速深化LCA新基因的发现，采用TALEN定点诱变技术构建小鼠Nmnat1突变型载体，显微注射后胚胎移植，获得特异突变的小鼠品系。利用小鼠模型，从分子、细胞、组织和器官水平多角度开展对NMNAT1基因突变导致LCA的发病机理研究。同时利用药物补充，从生理病理比较观察小鼠模型的视力功能表型改变和治疗效果。利用腺相关病毒AAV载体对模型小鼠进行视网膜下腔注射，阐明表型逆转干预的可能性。研究结果将为开发针对基因突变的靶点药物和适宜干预技术的转化应用奠定重要基础。

天性黑蒙症（LCA）是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变，全球新生儿患病率是1/35,000。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶（NMNAT1）是一个六聚体，广泛表达于各个组织，催化NAD+生物合成的最后步骤。NMNAT1基因突变可以导致第9型先天性黑蒙症，患者在出生后2个月即表现出视网膜萎缩、眼球震颤等症状。携带NMNAT1无意突变的患者，在刚出生即可检测到黄斑缺损。NMNAT1基因的突变如何引起LCA的发生机制尚不清楚，但绝大多数研究将致病原因归根于突变引起的NMNAT1蛋白酶活力的降低。目前为止，LCA9尚无有效的治疗方法。.为研究NMNAT1突变的致病机制，根据患者的突变位点，利用PCR定点突变技术构建了NMNAT1突变基因，并通过酶切构建突变型及野生型pEGFP-NMNAT1, pCMV-NMNAT1及pET30a-NMNAT1重组质粒。通过细胞免疫荧光实验确定两个无意突变（Trp85*和Trp169*）改变NMNAT1蛋白的细胞定位，从而影响蛋白功能的发挥。体内酶活实验及体外酶活实验分别用于检测突变对NMNAT1酶活力的影响。酶活实验结果显示Val98Gly突变催化合成的NAD+量明显下降，提示Val98Gly突变显著降低蛋白酶活力。由于NMNAT1是稳定的6聚体结构，半衰期很长，很难通过细胞实验观测到突变对蛋白稳定性的影响。所以通过使用生物信息学分析，预测各个突变点对NMNAT1基因内作用力的影响，判断突变氨基酸对蛋白稳定性的影响。.为研究LCA9型疾病的治疗方法，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，根据患者突变类型构建NMNAT1-LCA9小鼠模型。通过视网膜电图，眼底成像及光学相干断层扫描检测检测小鼠的表型。眼底成像结果显示，小鼠出生3个月后眼底出现针尖样白斑，但视网膜各层并未出现异常，视网膜层状结构完整。观察至32周可见眼底病症加剧，针尖样白斑分布密集，但视网膜结构仍保持完整，并无缺损。与Val152Leu/Glu258Lys和Glu258Lys/Glu258Lys突变相比Met172Aspfs*22/Glu258Lys小鼠眼底表型出现较早，后期表型恶化严重，眼底针尖样白斑分布更为密集。组织切片结果显示，早期NMNAT1-LCA9小鼠视网膜并未明显变化，10个月之后，感光细胞外核层变薄。.关键词：LCA9，NMNAT1，酶活力，基因治疗

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