构建模块化组合型启动子同源介导重组改造芽孢杆菌强化合成新型抗真菌次级代谢产物

The PKS gene clusters due to synthesis of Haixinmycin will be located and cloned using genome walking method. The core sequence of the promoter, ribosome binding site and transcription regulation unit sequences libraries will be constructed, respectively. Then combined promoter library will be established using modular combinations. The optimization of combined promoter could strengthen the binding of the ribosome, and RNA polymerase sigma factors, which could control the expression of many genes. The native promoter of the PKS gene cluster will be replaced with stronger promoter using Red/ET homologous recombination, thus the homologous expression will be achieved to improve the production of target antifungal secondary metabolite -Haixinmycin. Furthermore, the effects of different combined promoter on Haixinmycin production, PKS enzymes, and PKS gene cluster expression levels will be elicited via real-time dynamic and quantitative research on gene transcription and expression levels of PKS structural genes. This project could supply experimental methods and theoretical guidance for the establishment of combined promoter and homologous expression to improve new secondary metabolite production.

本项目拟采用步移法定位并克隆细菌中与海新霉素生物合成相关的聚酮酶（PKS）基因簇，在此基础上，分别构建启动子核心序列、核糖体结合位点和转录调控单元序列文库，并模块整合建立组合型启动子文库。启动子的模块化组合优化可以全方位强化与核糖体和RNA聚合酶σ因子的结合，调节和优化基因簇中多个基因的表达。通过对重组子的筛选，利用同源介导重组技术将获得的组合型强启动子整合到染色体PKS基因簇结构中取代原有启动子，实现在原始菌株中高效表达目标化合物- - 海新霉素。进一步通过对PKS基因簇中结构基因的转录和表达水平的实时动态和定量研究，明确组合型启动子对PKS基因簇转录、PKS酶系表达和产物生物合成的影响。项目的研究可为建立同源介导重组染色体置换启动子及原位表达改造微生物高产次级代谢产物的方法提供实验技术和理论指导。

本项目采用步移法定位并克隆细菌中与海新霉素生物合成相关的聚酮酶（PKS）基因簇，构建了启动子核心序列、核糖体结合位点和转录调控单元序列组件，建立了组合型启动子文库。启动子的模块化组合优化可以全方位强化与核糖体和 RNA 聚合酶σ因子的结合，调节和优化基因簇中多个基因的表达。通过对重组子的筛选，利用同源介导重组技术把构建的组合型强启动子整合到染色体 PKS 基因簇结构中取代原有启动子，实现在原始菌株中高效表达目标化合物。进一步通过对 PKS 基因簇中结构基因的转录和表达水平的实时动态研究，明确了组合型启动子对 PKS 基因簇转录、 PKS 酶系表达和产物生物合成的影响。项目的主要研究内容包括：1）海新霉素合成PKS基因簇结构与功能的研究；2）目标产物合成PKS基因簇模块化组合型启动子文库的构建及组合型强启动子筛选；3）同源重组介导染色体原位置换Bacillus sp. CGMCC 4140 的启动子；4）启动子强化对PKS基因簇转录、PKS酶系表达和产物—海新霉素生物合成的影响。通过项目的研究获得了以下成果：1）发展了一种快速、高效、便捷的用于构建重组质粒的CPEC克隆方法；2）以P43为基础通过对启动子模块功能的分析，采用饱和突变建立了启动子文库，筛选获得了组合型强启动子；3)利用同源介导重组技术将强启动子原位整合替换成功得到阳性转化子；4）摇瓶发酵条件下，转化子培养液中海新霉素的效价比原始菌提高了80%；5)通过对发酵条件的优化, 在3T罐中进行了转化子的中试发酵，发酵液对白色念珠菌标准菌株的抗真菌效价在30 h时平均达到了8500U/mL，比原始菌株提高了3倍。项目的研究成果可以进一步明确PKS基因簇与海新霉素合成的相互关系，并为代谢途径不明确次级代谢产物的高效表达提供了理论方法和技术借鉴。

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