钙蛋白酶及其抑制蛋白在表皮桥粒结构异常性皮肤病的致病作用

Calpains are a group of calcium-dependent, non-lysosomal cysteine proteases which are ubiquitously expressed in mammalian cells and involved in the proteolysis of various proteins. Calpastatin, encoded by the CAST gene, is the only known endogenous inhibitor of calpains and is co-localized with calpains in cytosol. Previously we have found that loss-of-function mutations in CAST caused PLACK syndrome, an autosomal-recessive disorder characterized by skin fragility and peeling. Deficiency in calpastatin leads to defective epidermal adhesion, characterized by acantholysis and aberrant expression of desmoplakin. Based on these results, we assumed that balance of the calpain-CAST system is crucial for the homeostasis of desmosome, an important structure of epidermal cell-cell adhesion. We seek to determine the target desmosomal component which is proteolysed by over-activated calpains using the skin tissues of patients with PLACK syndrome, the siRNA-knockdown HaCaT cells and co-immunoprecipitation. Then we choose to study two relatively common acantholytic disorders, Hailey-Hailey disease and Darier disease, to find out whether imbalance of the calpain-CAST system is involved in the pathogenesis of acantholysis. This study is expected to determine the role of the calpain-CAST system in epidermal adhesion, and shed new light on the pathogenesis of acantholytic disorders.

钙蛋白酶是广泛分布于人体各种细胞内的钙依赖半胱氨酸蛋白酶，参与多种细胞蛋白的蛋白酶解过程。钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）与钙蛋白酶共表达于细胞浆中，是其体内特异性抑制剂。申请者发现CAST基因突变可以引起PLACK综合征，一种以皮肤剥脱为主要特征的疾病。CAST缺失导致表皮棘层松解，桥粒斑蛋白表达紊乱。据此，申请者推测钙蛋白酶及其抑制蛋白系统很可能在桥粒结构的稳定性中发挥重要作用。我们拟在前期研究的基础上，通过PLACK患者皮肤组织标本、培养细胞siRNA敲低CAST表达模型，以及免疫共沉淀方法，明确CAST缺陷时，桥粒结构中被钙蛋白酶酶解的组成蛋白。进而我们选取两种钙相关性棘层松解性皮肤病——慢性家族性良性天疱疮及毛囊角化病进行钙蛋白酶及其抑制蛋白系统表达及活性研究。本研究有望确定钙蛋白酶及其抑制蛋白系统在表皮细胞间粘附中的作用，为临床上棘层松解性皮肤病提供全新致病机理及治疗靶点。

在本课题的资助下，我们进行了大部分实验研究计划，包括对HaCaT细胞及HEK293细胞的CAST基因进行siRNA敲低实验及蛋白表达验证，以及CAST基因敲低后HaCaT细胞的粘附、迁移能力，及细胞间的桥粒的研究，同时对Hailey-Hailey病（HHD）和Darier病（DD）患者的皮肤标本中，进行了桥粒结构相关蛋白plakoglobin、Dsg 1和Dsc 1的免疫荧光及免疫组化染色，以及calpain和CAST蛋白的免疫荧光及免疫组化染色。研究计划大部分得到执行，部分研究计划因客观原因未能执行。结果我们发现：体外构建的calpain蛋白活性下降与正常对照（mock敲低的HaCaT作为对照）未检测到明显区别，基因敲低后HaCaT细胞的粘附、迁移能力无明显差别。对于HHD及DD的研究结果我们发现，HHD和DD的患者CAST蛋白和calpain蛋白表达均较正常人略有上升，患者的桥粒结构蛋白plakoglobin、Dsg 1和Dsc 1表达较正常人略有下降。当纳入更多的HHD和DD的患者，重新进行类似实验，并且进行统计分析之后，我们发现这些差别没有统计学意义。.本课题研究中我们确定了calpain-CAST 系统并不参与PLACK综合征以外的棘层松解性皮肤病，包括HHD和DD疾病发生的病生理过程。进一步研究有赖于动物模型的建立，比如构建CAST基因皮肤条件敲除小鼠进行研究。.利用本课题研究资助，我们进行性对称性红斑角化症（伴有遗传性掌跖角化症表现）进行了新致病基因的研究，结果揭示了一种遗传性角化性皮肤病的全新致病基因，更重要的是也阐述清楚TRPM4通道在心脏和皮肤发挥的不同功能，为今后开发针对TRPM4的靶向阻断药可能的效果、不良反应的预测提供了重要的依据和疾病模型。此外，还进行了一系列单基因遗传病的致病基因突变研究。.本课题资助下，我们发表了8篇SCI文章及一篇中文论著（两篇IF>5），毕业了一名硕士及博士生，课题负责人获得了科技部中青年科技创新领军人才及国家“万人计划”科技创新领军人才。.

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