徳沃斯氏菌对真菌毒素DON的去毒机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
30901006
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
22.0万
负责人：
徐剑宏
依托单位：
江苏省农业科学院
学科分类：
C2008.食品质量与安全检测
结题年份：
2012
批准年份：
2009
项目状态：
已结题
起止时间：
2010-01-01 至2012-12-31

项目参与者：
史建荣；祭芳；王建伟；薛秋艳；王宏杰；
关键词：
解毒基因 DON毒素解毒酶去毒机制。代谢途径

项目摘要

DON是一种重要的真菌毒素，不仅影响农作物的产量和品质，造成巨大的经济损失，还会对人畜安全构成威胁。利用微生物法去除毒素具有专一性好、效率高、无二次污染等优点，具有很好的应用前景。本研究以从环境中筛选到的DON高效降解菌株Devosis sp. DDS-1为研究对象，通过液质联用、核磁共振和红外光谱等手段分析DON降解过程中生成的产物，推导出DON的降解途径；基于降解途径的结果，分析关键解毒酶，利用酶的分离纯化技术纯化毒素解毒酶；通过Edman反应对纯化酶进行氮端测序，并根据测序结果设计简并引物探针，利用 southern 杂交和和染色体步行等手段克隆毒素解毒酶基因，进行重组表达；研究毒素解毒酶和重组酶的特性，从代谢途径、解毒酶基因和解毒酶等多角度阐明DDS-1对DON的解毒机制。以求找到真菌毒素高效、安全的解毒方法，进而保障农作物的产量与品质，确保食品安全，避免真菌毒素对人类健康的影响。

结项摘要

本研究以能够高效降解DON毒素的高效降解菌株DDS-1为研究对象，经过生理生化特性和系统发育进化树的分析，该降解菌株被鉴定为德沃斯氏菌属Devosis sp. 。通过研究DDS-1对DON毒素和其它单端胞霉烯族毒素的降解特性， DDS-1 在30℃，pH 9.0，好氧条件下降解DON毒素的效果比较好；DDS-1不但能够很好地降解液体培养基和饲料中的DON毒素，而且对其它的单端胞霉烯族毒素，如：3AC-DON、 15AC-DON、T2-毒素、NIV毒素等都有很好的降解功能。采用薄层层析分离纯化了DDS-1 降解DON毒素在不同时间的降解产物，然后经过HPLC-MS分析降解产物的分子量和碎片离子，明确了DDS-1对DON毒素的降解途径，DDS-1降解DON毒素时，首先把DON转化成15ADON，然后再生成15-酮基-4-DON，但15-酮基-4-DON不是最终的产物，还能继续往下降解。DDS-1降解3AC-DON的酶学研究结果显示降解菌DDS-1产生3-AC-DON氧化酶的最适条件为：pH值7.0、30℃、培养36小时；该酶酶反应的最适温度为35℃，最适反应pH为7.0；该酶在20-40℃，pH 5.0-9.0的范围内能保持80%以上的酶活；大多数金属离子在浓度在为0.2 mmol L-1和2 mmol L-1时对3-AC-DON氧化酶有促进作用，乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶活有抑制作用；酶的定域实验结果显示该酶为胞内酶。本研究构建了DDS-1 全基因组的Fosmid 文库，通过逐一检测文库中克隆对DON毒素的降解能力，筛选到了三个具有降解DON毒素能力的阳性克隆；同时对DDS-1的全基因组进行了测序，通过对测序结果进行分析，推测到一些与DON毒素降解相关的基因，把这些基因进行了功能验证，得到一个与DON毒素降解相关的基因。把DON毒素解毒基因Tri101基因连接至表达载体pET29a上，进行了原核表达，并利用HisTrap亲和柱纯化了蛋白。为了确保降解菌和降解产物在生产上的安全使用，本研究还对降解菌株进行了小鼠毒性实验和对小麦的毒性实验，结果显示DDS-1对小鼠和小麦均无毒性。本研究已发表文章4篇，其中一篇SCI, 投稿2篇，申请国家专利4项，其中两项获得授权，毕业硕士研究生2名，2名在读。本研究工作作为部分研究内容申请了江苏省科技进步奖，并获得了三等奖。