建立在血细胞重编程为iPSC的过程中同时实现高效基因编辑的方法

Integration-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) hold a great promise for regenerative medicine. Human peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs) are one of the most available source cells for iPSC generation. We have developed an improved episomal vector (EV) system for efficient generation of integration-free iPSCs from PB MNCs, which can be genome-modified at an efficiency of up to 30% by homology-directed repair using our recently reported optimized double-cut donor CRISPR/Cas9 system. The conventional procedure of regenerative medicine is iPSC generation, followed by genome editing and directed differentiation, which is time-consuming and unaffordable. Here we propose a more feasible approach, which integrates reprogramming and genome editing in a single step. We will further optimize genome editing vectors, screen factors that can increase genome editing efficiency and improve iPSC quality. We anticipate establishing a highly efficient approach for simultaneous reprogramming and genome editing of PB MNCs. The genome editing efficiency is expected to be up to 50%, which will lay a solid foundation for precision and regenerative medicine.

非整合型诱导多能性干细胞（iPSC）在基础研究和临床应用中有重要意义。人外周血单个核细胞(PB MNC)是制备iPSC的最佳来源之一。我们新近报道，利用游离型载体（EV）系统，可以把PB MNC高效转化为非整合型iPSC。我们还发现，利用优化的CRISPR/Cas9载体系统，在iPSC中的精准基因编辑效率提高了~5倍。目前基于的iPSC的再生医学方案治疗为，先制备iPSC，然后通过基因编辑修复致病基因，最后定向分化为功能细胞。但该方法耗时长，成本高。如果能在重编程过程中同时实现基因编辑，将加速iPSC进入临床治疗的步伐。我们将利用新的基因敲入载体，整合Cas9和重编程因子，同时筛选可以进一步提高基因编辑效率的小分子化合物和iPSC质量的新基因。我们将建立在重编程过程中同步实现高效基因编辑的方法，预计单基因编辑效率可达50%，并实现多位点同时高效率基因编辑，为精准医学研究和临床应用奠定基础。

我们研究组具备利用游离型载体进行高效率的血液细胞重编程技术，重编程得到的iPSC在“双切载体”供体模板和CRISPR-Cas9技术的介导下能够实现高达30%的基因敲入效率。通过本项目，我们将二者整合，实现了一步法对血细胞进行重编程同时实现基因编辑。通过对载体的优化设计，将Cas9载体和KLF4载体利用2A连接到一个表达载体上，能够提高重编程时的基因编辑效率。对多个因子的进一步筛选结果表明，SV40LT能够进一步提高基因敲入效率。通过我们优化的重编程同时进行基因编辑的方法，重编程得到的iPSC不经过筛选就能够达到20%-40%的基因编辑效率。这将为今后的精准医疗和再生医学领域的研究奠定坚实的基础。

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