新型O-乙酰葡糖胺-6-磷酸蛋白糖基化的检测、过程机理及生物功能研究

The protein O-GlcNAc6P modification, i.e., O-GlcNAc glycosylation with a phosphate group at 6 carbon of the N-acetyl glucosamine (GlcNAc) sugar ring, is a recently discovered posttranslational modification on proteins. It may play important roles in various biological processes, such as the transmission of neural signals, cell signaling pathways, and gene regulation. The studies on this modification are still in the beginning stages. There lacks effective method to enrich and detect this modification, as well as knowledge on its distribution, biochemical pathway and biological functions. In this grant, we first aim to develop specific methods to detect, enrich and analyze O-GlcNAc6P modification, including the synthesis of O-GlcNAc6P modified glycopeptides or their analogues, the production of specific antibodies against this modification, and the development of chemoenzymatic labeling method. We then aim to establish model systems of cell and proteins for its investigation. Based on these methods and models, the enzymes involved in the biochemical pathway will be identified. The biological functions of O-GlcNAc6P will be explored as well. This project will start a new innovation direction for protein glycosylation field. As output of this project, 4 to 8 high-level research reports will be published in important international journals. The applicant and the research group have solid foundations on related aspects of this project, including the synthesis of sugar nucleotides and their derivatives, the exploitation of glycosyltransferases, the chemoenzymatic and metabolic labeling of glycans. Moreover, the equipment and conditions of the supporting institution will facilitate the smooth implement of this project.

蛋白O-GlcNAc6P修饰即氮-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）糖环6位磷酸化的O-GlcNAc糖基化修饰，是一种新近发现的蛋白翻译后修饰，可能在神经信号传递、信号通路、基因调控等生命过程中具有重要作用，而其研究尚处于起步阶段，缺少有效的检测和富集手段，其分布、生物过程及功能尚无研究。项目拟开发O-GlcNAc6P修饰的检测、富集及分析方法，包括O-GlcNAc6P修饰的糖肽或其类似物的合成，特异性抗体的产生及化学酶反应标记方法的开发，进而建立O-GlcNAc6P研究的细胞及蛋白模型，鉴定O-GlcNAc6P修饰相关催化酶类，阐释其生物过程，探索其生物学功能。项目将开拓蛋白糖基化研究新的创新方向，预计在国际重要学术刊物上发表高水平论文4-8篇。申请人及其所在课题组在糖核苷酸及其衍生物合成、糖基转移酶研究、糖的化学酶法及代谢标记等方面具有坚实研究基础，依托单位设备条件将保证项目顺利开展。

糖链包括寡糖、多糖及其缀合物等具有重要生物学作用。项目围绕蛋白糖基化的化学酶法标记及重要糖链的化学酶法合成开展研究工作。项目主要研究内容及取得的重要结果包括4个方面。.在蛋白O-GlcNAc糖基化方面，合成了GlcNAc及6-磷酸-GlcNAc端基巯基化的衍生物，作为GalT的受体底物；对优化后的BGalT-Y289L与Hp1-4GalT编码基因序列进行了人工合成，获得了一系列BGalT-Y289L和Hp1,4GalT表达载体，大肠杆菌表达后获得了可溶的、有活性的目的蛋白；虽然研究结果表明两种GalT都不能以6P -GlcNAc衍生物为受体底物，但两种GalT可溶性表达的实现为O-GlcNAc糖基化标记及相关糖链的合成提供了更易于获得的工具酶。.在蛋白糖苷合成方面，建立了糖苷磷酸化酶催化高效合成1,2-顺式甘露糖苷及蛋白N-糖链核心三糖的方法；利用5种底物特异性不同的β-甘露糖苷磷酸化酶，实现了含有β1-2/3/4-甘露糖苷键的8种天然甘露糖苷的合成；利用1种GlcNAc糖苷磷酸酶及1种甘露糖苷磷酸酶，不需昂贵糖核苷酸底物实现了蛋白N-糖链核心三糖的高效合成，具有潜在应用价值。.另外，参与建立了一种巯基衍生标签介导的糖链酶法合成及固相分离策略。寡糖还原端巯基衍生后作为化学酶法糖合成的起始受体底物，可以经巯基亲和固相载体富集，实现了GM1糖抗原、ABH血型抗原、聚乳糖胺寡/多糖及其衍生物的高效合成。.在糖核苷酸合成研究方面，由微生物中筛选到一种单糖激酶PbAraK，可以识别L-阿拉伯糖及L-核糖合成相应的糖-1-磷酸，在酶学研究基础上，建立了一锅三酶生物合成UDP-阿拉伯糖的方法。较化学合成相比步骤简单、经济高效，具有潜在应用价值。.项目取得的成果包括SCI收录论文2篇，其中一篇影响因子大于10；申请发明专利1项；培养博士研究生1人，硕士研究生2人。

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