HSF4-p53轴在晶状体发育和白内障发生中的作用机制研究

Cataract is the chief culprit caused blindness. Mutations of HSF4 lead to congenital cataract, but the underline molecular mechanisms remain obscure. Previously, we found that HSF4 interacted with and stabilized tumor suppressor protein p53 and caused cell cycle arrest in human lens epithelial cells. However, the physiological function of HSF4-p53 interaction, especially in lens development and congenital cataract, were largely unknown. To this end, we have constructed HSF4-null cataract zebrafish model via the TALEN technology. In this study, we will utilize zebrafish to reveal the fine tune of HSF4-p53 interaction and how this interaction affects lens development. We will further monitor the lens development and progress of congenital cataract in HSF4-null, p53 deficient and HSF4/p53 deficient zebrafishes. If our project was supported by NSFC, we will be able to uncover critical role of the HSF4-p53 axis in the regulation of lens development and congenital cataract, and might provide new insights in pathogenic mechanisms and treatment of cataract.

白内障是导致人类失明的首要原因，HSF4突变可引起先天性白内障，但其中的病理机制尚不清楚。我们前期发现在晶状体上皮细胞中HSF4结合并稳定肿瘤抑制蛋白p53，最终导致晶状体上皮细胞的周期阻滞。然而，HSF4稳定p53的生理意义--特别是其对晶状体发育的影响和在先天性白内障中的作用还未得到深入阐释。为此，我们还进一步利用TALEN技术成功构建了HSF4缺陷的白内障斑马鱼模型。本项目将着重采用斑马鱼为模式生物，研究HSF4稳定p53的精细分子机制和对晶状体发育的影响，深入分析HSF4缺失、p53缺陷和HSF4/p53双缺陷斑马鱼的白内障发生和发展过程。本项目如获资助并顺利实施，将阐明HSF4-p53轴在晶状体发育和先天性白内障中的意义，为先天性白内障的致病分子机制研究与治疗提供新的方向。

HSF4突变可引起先天性白内障，我们前期发现在晶状体上皮细胞中HSF4结合并稳定肿瘤抑制蛋白p53，最终导致晶状体发育异常。然而，HSF4稳定p53的生理意义--特别是其对晶状体发育的影响和在白内障中的作用还未得到深入阐释。.为了研究HSF4对晶状体发育过程的影响，构建了HSF4缺陷斑马鱼，观察不同时期的晶状体浑浊表型，组织切片染色分析晶状体分化异常原因，发现了初级纤维细胞去核化障碍。细胞去核化过程与凋亡信号通路相关，为了探明p53凋亡相关靶基因是否参与HSF4缺陷斑马鱼纤维细胞去核化障碍，我们首先确定p53凋亡相关靶基因是否受到HSF4调控。在细胞水平上过表达与干扰HSF4，检测p53凋亡相关靶基因Fas、Bax的蛋白与RNA水平变化，发现它们受到HSF4正调控。随后我们在HSF4缺陷斑马鱼中回补HSF4、p53及其凋亡相关靶基因，发现缺陷表型减弱，确定了HSF4-p53轴及其凋亡相关靶基因在初级纤维细胞去核化障碍中的关键作用。.为了研究了HSF4对p53的精细调控机制，免疫共沉淀实验检测p53与MDM2之间的互做是否受到HSF4影响，p53在细胞中的含量主要受到翻译后修饰及E3泛素连接酶MDM2调控，发现HSF4可减弱p53与MDM2的互做，而HSF4突变型丧失该作用。进一步分析HSF4对p53翻译后修饰的影响发现，p53 S15位点发生磷酸化，还发现与转录激活相关的K305 和 K382位点发生乙酰化。.此外，我们还发现了HSF4新的靶基因-血红素氧化酶-1（Heme oxygenases-1,HMOX-1）。该基因在细胞氧化损伤应激过程中发挥重要作用，而细胞氧化损伤被认为是白内障发生的主要原因之一，同时有文章报道HSF1可转录激活HMOX-1。为了探究HSF4是否也能调控HMOX-1，在细胞水平上过表达与干扰HSF4，检测HMOX-1的蛋白与RNA水平变化，发现它受到HSF4正调控。荧光素酶实验证实了HSF4直接结合HMOX-1基因启动子并转录激活HMOX-1。.综上所述，我们在蛋白水平上阐明了HSF4调控p53的分子机制，在细胞和动物水平上阐明了HSF4-p53轴在晶状体发育与白内障发生中的作用机制。我们还发现了HSF4新的氧化损伤应激相关靶基因，丰富了HSF4调控网络，提示HSF4介导的氧化损伤应激可能参与晶状体损伤修复。

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