海带褐藻胶合成关键酶基因识别及功能鉴定

Alginate, a linear copolymer composed of variable proportions of 1,4-linkedβ-D-mannuronic acid and its C-5 epimer α-L-guluronic, is the main cell-wall constituents of brown algae. Alginate has been widely used in food, pharmaceutical and other industries. It also shows a great potential in bioethanol and biofuels preparation as high energy substances from macroalgae. In order to reconstruct the biosynthesis pathway of alginate in eukaryotes, this project intent to focus on the brown alga- kelp (Saccharina japonica), which is the main source of commercially available alginate in China. Firstly, gene expression profiles of kelp with different alginate content will be constructed using high throughput transcriptome sequencing and compared with each other in order to explore alginate biosynthesis related enzyme genes using bioinformatics analysis. Secondly, investigate the expression pattern of these related enzyme genes in the development of kelp by real-time PCR to identify the key enzyme genes. Thirdly, clone the full-length cDNA of key enzyme genes, recombine the enzyme protein and examine the biochemical functions they performed. The present project will provide the theoretical basis for constructing the biosynthesis pathway of alginate, understanding its molecular regulation mechanism and breeding kelp of high-content alginate. In addition, phylogenetic analysisof alginate biosynthesis key enzymes will be performed, which would provide theimportant evidence for origin and evolution of cell wall polysaccharide ineukaryotes.

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种糖单元通过1,4-糖苷键相连接聚合而成的线性多糖分子，是褐藻细胞壁的特有组成成分。褐藻胶广泛应用于食品、医药等产业中，并在生物燃料制备方面显示出巨大潜力。本项目拟以我国褐藻胶生产的主要来源—海带为研究对象，以前期研究获得的海带褐藻胶含量动态变化规律为依据，采用RNA-seq技术对海带发育过程中褐藻胶含量显著变化时期的差异表达基因进行高通量筛选；通过real-time PCR技术研究相关基因在海带发育过程中的表达模式，识别海带褐藻胶合成关键酶基因；通过基因克隆和原核表达技术，从分子、生化水平对关键酶基因及其功能进行验证和鉴定。该项目为深入解析海带褐藻胶生物合成途径，进一步揭示褐藻胶高效合成分子机制，开展高褐藻胶海带良种选育奠定基础，并为真核生物细胞壁多糖的起源和进化研究提供重要的分子依据。

褐藻胶是是褐藻细胞壁的特有组成成分，已广泛应用于食品、医药等产业中，并在生物燃料制备方面显示出巨大潜力。海带（Saccharina japonica）是我国养殖面积和产量最大的经济褐藻，也是我国生产褐藻胶商品的主要原料，但海带褐藻胶合成途径及调控机制还不清楚。本研究利用海带配子体无性繁殖系杂交方法获得遗传背景一致的海带孢子体；在海带孢子体筏式栽培期间，取6个时间点进行了表型（生长性状及多糖含量）性状和环境因子测定，结果表明褐藻胶含量与海带生长速度具有相似的变化模式。根据上述海带表型性状动态变化，选取海带孢子体发育时期的4个时间点的12个样本进行RNA-seq测序；共产生了589M clean reads，鉴定出4,514个新基因；共筛选2542个差异表达基因，GO富集分析显示，在“代谢过程”，“细胞”和“催化活性”GO term中，基因占比最高；KEGG富集分析显示，“碳代谢”，“光合作用”和“光合作用-天线蛋白”途径被显着丰富，为在海带中鉴定多糖生物合成基因奠定了基础。通过生物信息学分析，识别了海带多糖（褐藻胶、褐藻糖胶、纤维素、甘露醇、褐藻淀粉、海藻糖）合成关键酶候选基因；基于qRT-PCR基因表达验证以及与褐藻胶含量共调控关系，进一步筛选了8个海带褐藻胶合成关键酶基因。对褐藻胶关键酶基因SJGMD3-SJ11033进行全长克隆、原核表达及酶动力学研究，确认了其在褐藻胶合成途径中的关键作用。基于获得的转录组序列，开发了鉴定海带配子体性别分子标记，并获得了海带雄性特异基因sjhmg全长及其在各个发育阶段的表达模式。本项目的结果为褐藻胶代谢途径重建以及高褐藻胶含量的海带良种选育提供了理论依据，也为海带性别决定基因的鉴定和性别决定调控机制的解析奠定了基础。

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