基于五环三萜-HR2螺旋结构域选择性结合广谱抑制病毒-细胞膜融合的机制研究

Drug development targeting viruses entry into host cells is an efficient approach to overcome or reduce drug-resistant due to the high mutation rate of RNA viruses. Previous studies showed that pentacyclic triterpenes can significantly inhibit the RNA viruses entry into host cells. However, the exact broad antiviral mechanism is not clear. Based on the anti-HIV entry activity of betulinic acid and the anti-HCV, influenza and Ebola activities of certain pentacyclic triterpenes, here we make a proposal by design and synthesis of a series of triterpene probes with photo-crosslinking (and biotin) functional groups based on the identified lead compounds, and then incubation and photo-crossing of the probes with the various membrane protein of viruses and characterize by mass spectrum. Upon the identification of the crossing peptides, we utilize the modern technologies such as surface Plasmon Resonance (SPR) and NMR to identify the binding affinity and binding specify. Finally, the molecular modeling of pentacyclic triterpene and the binding pocket of targeting protein will be carried out by computer aided drug design to identify the potential three-dimensional conformation. This study will be helpful to understand the regulating of membrane fusion process between pentacyclic triterpenes and viruses and provide the theoretical and experimental evidences to prove the broad antiviral entry activity of pentacyclic triterpenes.

以“病毒进入细胞”为靶的新型抗病毒药物的研究是克服和延缓因RNA病毒自身基因高突变率而带来耐药性的有效途径。前期研究发现某些五环三萜具有抗多种RNA病毒进入细胞的活性，但其广谱的抗病毒作用机制并不十分清楚。本课题基于文献报道的白桦脂酸的抗HIV进入活性及我们前期研究发现的五环三萜衍生物抗丙肝、流感及埃博拉等病毒进入活性的基础上，设计并合成多个系列的双吖丙啶（和生物素）标记的小分子探针，运用光交联及蛋白质谱等技术捕捉五环三萜与丙肝病毒E2蛋白、流感病毒HA蛋白、埃博拉病毒GP蛋白及艾滋病毒gp41蛋白的结合位点，并运用表面等离子共振及核磁共振技术研究五环三萜与上述靶蛋白结合的亲和力和特异性，进而借助计算机辅助药物设计手段模拟五环三萜与病毒膜蛋白HR2结合位点的相互作用模式，阐明五环三萜广谱调控病毒膜蛋白与宿主细胞膜融合的分子机制，为新型五环三萜类抗病毒进入抑制剂的研发提供理论和实验基础。

病毒感染的上游节点——病毒进入细胞，因涉及病毒与宿主细胞的识别、结合和感染的起始过程，因而成为了人类认识病毒、操控病毒甚至改变病毒宿主性的重要切入点。国内外的研究表明，广泛分布于植物界的五环三萜类天然产物可通过干预病毒与宿主细胞的相互识别，从而抑制埃博拉、艾滋、流感、丙肝等多种RNA病毒感染宿主细胞，然而目前国际上针对五环三萜类化合物抑制病毒进入细胞的具体作用机制尚未有深入的研究。本项目以五环三萜为结构母核，设计并合成了一系列带有diazirine光交联基团的分子探针，在紫外照射条件下实现五环三萜探针与病毒膜蛋白的共价交联，进而通过对共价复合物的分离和蛋白质组学鉴定分析，发现了五环三萜探针能特异性与埃博拉、流感、艾滋等RNA病毒的囊膜蛋白共有的结构域七肽重复序列（heptad repeat-2, HR2）结合。HR2是一段I类病毒膜融合蛋白高度保守的α螺旋样序列，也是五环三萜特异的结合并调控多种RNA病毒与相应宿主识别的关键结构域。进一步综合运用点突变、圆二色散、表面等离子共振等技术发现HR2中的六个非极性氨基酸是与五环三萜高亲和性结合的关键，并利用分子模拟与核磁共振技术研究了HR2序列与五环三萜分子之间的相互作用。该研究将HR2这种原本“undruggable target”变成“druggable target”，为抗病毒药物的研发提供了新的潜在靶点。总之，本项目揭示了自然界的五环三萜类先导物与不同病毒膜蛋白结合的共性结合位点，阐明了五环三萜调控同种起源RNA病毒与相应宿主识别的共性分子机制，为“五环三萜天然物是大自然调控病毒与宿主识别的生物进化产物”科学学说提供依据。本项目相关研究共发表SCI论文十三篇，其中在本领域权威刊物J. Med. Chem.发表论文两篇，在Eur. J. Med. Chem.及Mol. Pharm.各发表论文两篇，项目负责人应邀参加全国性学术会议两次并作口头报告一次，学生做快闪报告并获奖一次，申请国内专利一项，培养博士研究生一名（在读），硕士研究生六名。

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