TGF-β通过调节ADAMTS-7介导风湿性心脏病瓣膜纤维化的分子机制研究

Valvular fibrosis is the major pathological change in rheumatic heart disease, however, the fibrosis mechanism is still elusive. In our preliminary experiment on rats, we found that TGF-β level is increased, while metallproteinase ADAMTS-7 is downregulated and its enzymatic substrate- cartilage oligomeric matrix protein (COMP) is upregulated, whether their change is correlated with the valvular fibrosis is not clear. Valvular interstitial cells( VICs) differentiation into myofibroblast like phenotype is closely related to valvular fibrosis, in vitro experiment using VICs primary culture showed that TGF-β could induce VICs differentiation, meanwhile, upregulated COMP and downreguated ADAMTS-7; Overexpression ADAMTS-7 in VICs could significantly reduce the level of COMP. Therefore, we propose our hypothesis: TGF-β induces VICs differentiation via downregulation of ADAMTS-7 and reduce the degradation of its enzymatic substrate COMP. We will further prove the expression of these three proteins, and explore the molecular mechanism for the negative regulation of ADAMTS-7 by TGF-β, so that we could elucidate the pathogenesis of rheumatic heart disease.

瓣膜纤维化是风湿性心脏病的主要病理表现，其发生机制尚未阐明。我们在风心病动物模型中发现：TGF-β表达水平升高，同时金属蛋白酶ADAMTS-7表达水平降低，ADAMTS-7的降解底物--软骨寡聚基质蛋白COMP表达水平升高，三者表达水平变化与瓣膜纤维化是否有关尚不清楚。瓣膜间质细胞VICs向肌成纤维细胞表型分化与纤维化紧密相关，原代培养的VICs细胞实验显示：TGF-β可显著诱导VICs分化同时上调COMP 并下调ADAMTS-7水平，而过表达ADAMTS-7可降低COMP水平。基于以上前期研究结果，我们提出：TGF-β可通过下调ADAMTS-7表达以减少其对COMP的降解这一途径促进瓣膜纤维化。本项目拟进一步在动物模型及细胞实验中证实三者的功能性表达，并探讨TGF-β负性调控ADAMTS-7表达的分子机制，为进一步阐明风心病瓣膜病变发生机制提供更充分的科学依据。

瓣膜纤维化是瓣膜病的常见病理改变，瓣膜间质细胞（valve interstitial cells，VICs）由“静止”状态的成纤维细胞样表型“活化”为肌成纤维细胞样表型可视为瓣膜出现纤维化病变的早期标志性事件。COMP作为细胞外基质蛋白对细胞表型分化具有重要作用，但其对VICs活化的影响尚不清楚。而TGF-β1是诱导VICs活化与瓣膜纤维化的主要炎症细胞因子，它与COMP的关系也是值得探讨的问题。方法：组织学方法检测TGF-β1处理瓣膜后COMP、α-SMA蛋白的表达及分布；建立大鼠VICs原代培养体系，观察TGF-β1下游信号通路对COMP及相关活化指标的影响。将COMP过表达与COMP-shRNA质粒转染VICs，检测COMP、VICs活化以及纤维化相关指标变化。结果：组织染色显示，处理组胶原纤维沉积增加，免疫组化结果显示处理组细胞外基质及VICs胞质内中COMP蛋白表达增加，同时VICs 活化指标α-SMA水平也增加。TGF-β1处理原代VICs后，Smad2/3通路被激活，COMP及α-SMA水平显著上调，抑制Smad2/3激活后，COMP及α-SMA表达降低。与对照组相比，过表达COMP的VICs中 α-SMA、I型胶原及结缔组织生长因子（CTGF）等蛋白水平升高；敲低COMP基因后α-SMA水平降低，在此基础上加入TGF-β1可部分补偿COMP敲低所带来的影响，COMP、α-SMA、I型胶原及CTGF等表达均有显著上升。结论：1. 首次证实COMP表达于心脏瓣膜，VICs是其主要产生细胞。2.COMP可促进VICs由成纤维样表型向肌成纤维化表型转化。3.TGF-β1可通过Smad2/3信号通路调节COMP表达并促使VICs的活化。本研究为瓣膜间质细胞的活化机制奠定了新的理论基础，也为瓣膜疾病提供了潜在治疗靶点。

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