从CAR的缺失和过量表达对体外塞尔托利氏细胞上皮完整性的影响探索其对精子发生的调控作用

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31101043
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
23.0万
负责人：
苏琳琳
依托单位：
温州医科大学
学科分类：
C1206.生殖细胞及性别决定
结题年份：
2014
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2014-12-31

项目参与者：
李兴旺；叶雪飞；苏颖；王兰兰；郭晶晶；徐敏；
关键词：
柯萨奇病毒-腺病毒受体生精细胞迁移血睾屏障

项目摘要

精子发生中，生精细胞必须适时穿越生精上皮的血睾屏障以进一步发育,这非常类似病毒感染宿主细胞时通过宿主上皮紧密连接的过程。柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)是一种存在于多种上皮组织的细胞粘附蛋白，介导同型或异型细胞间的粘连。病毒侵染宿主细胞时，病毒用病毒-细胞CAR-CAR连接取代原有的细胞间CAR-CAR连接，从而穿越宿主上皮。在生精上皮中，CAR同时存在于塞尔托利氏细胞和迁移中的各期生精细胞，介导塞尔托利氏细胞间及塞尔托利氏-生精细胞间的连接。生精细胞很可能采用同样的策略：用生精细胞-塞尔托利氏细胞间的CAR-CAR连接取代原有的塞尔托利氏细胞间的CAR-CAR连接，从而穿越血睾屏障。基于CAR在生精细胞穿越血睾屏障的潜在作用，我们通过体外建立模拟血睾屏障的塞尔托利上皮屏障，在体外塞尔托利氏细胞培养体系中，分别采用基因沉默和过量表达技术，研究CAR的缺失或过量表达对上皮完整性的影响。

结项摘要

柯萨奇病毒-腺病毒受体（CAR）是一种存在于多种上皮组织的细胞粘附蛋白，介导同型或异型细胞间的粘连。在生精上皮中，CAR同时存在于塞尔托利氏细胞和迁移中的各期生精细胞，介导塞尔托利氏细胞间及塞尔托利氏—生精细胞间的连接。基于CAR在生精细胞穿越血睾屏障的潜在作用，我们通过体外建立模拟血睾屏障的塞尔托利上皮屏障，在体外塞尔托利氏细胞培养体系中，分别采用基因沉默和过表达技术，研究CAR的缺失或过表达对上皮完整性的影响及其中的分子调控机制。我们的研究发现：1）CAR RNAi伴随紧密连结接头分子ZO-1的显著下调，而其他检验的紧密连结蛋白、基底ES蛋白及桥粒连结蛋白的含量均未发生变化，因此通过减少BTB组成蛋白的表达水平从而破坏了BTB的完整性。2）CAR RNAi 引起了跨膜蛋白occludin在苏氨酸磷残基上磷酸化水平的显著降低，加强了occludin的内吞作用，使occludin由细胞膜转移到细胞浆，与EEA1的结合显著增加，从而通过改变BTB组成蛋白的分布使BTB稳定性下降，破坏了BTB完整性。3）CAR过表达伴随着ZO-1水平的显著上调和BTB屏障功能的增强，同时两个主要桥粒连接蛋白desmoglein-2和desmocollin-2的表达也显著升高，表明CAR过表达引起的BTB完整性增强不是CAR RNAi诱导的BTB屏障功能削弱的简单逆转，很可能是通过加强桥粒连接从而增强了BTB屏障功能。4）我们还对原有研究工作进行了横向拓展和深入探索，我们发现CAR RNAi引起 BTB结构蛋白内吞作用加强，然而内吞后的蛋白是被循环再利用还是被进一步降解还不明确。我们通过膜蛋白再循环功能检测和膜蛋白降解功能检测，结合免疫荧光双染色及免疫沉淀法共定位目的膜蛋白同再循环内体标志物或次级内体、溶酶体标志物，发现内吞后的occludin同转胞吞作用标志物caveolin的结合度显著降低，而同降解标志物rab9的结合明显加强。证明了CAR RNAi引起occludin内吞后不是参与形成新的BTB而维持BTB屏障功能，而是走向降解途径，使BTB结构受到破坏从而屏障功能受损。本研究通过探讨CAR在精子发生过程中对血睾屏障调控的分子机制，从而深入了解精子发生这一极其复杂的生物学过程，为开发潜在的新型男性避孕药提供了一个新型分子靶标，为揭示精子发生规律提供了理论依据。