细菌核糖体翻译延伸速率测定方法的改进

Quantitatively understanding the great differences of growth capacity among different bacteria species is one grand challenge in microbiology. Bacteria cells devote most metabolic and energy resources to protein synthesis. Protein synthesis therefore plays a central role in bacterial growth. Ribosome is engaged in protein synthesis. In vivo protein translation capacity depends on two key quantitative parameters, ribosome content and ribosome translation elongation rate. Ribosome content can be obtained by measuring RNA/protein ratio. However, traditional methods for measuring translation elongation rate have limited applications, thus it has been rarely reported of this parameter for different kinds of bacteria species. In our recent work, we developed a method of determining bacteria translation elongation rate based on the β-galactosidase alpha complementation system in E. coli. The method is rapid and convenient with excellent quantitative properties. However, its application is still mainly limited to E. coli. This research plan aims to improve this method and combine the green fluorescent protein reporter system for establishing a general method of measuring the translation elongation rate of other bacteria species. The new method will provide powerful technical support for understanding the intrinsic mechanism underlying the varied growth capacity among various bacteria species.

定量理解不同种类细菌之间生长能力的巨大差异是微生物学的重大研究难题。对于细菌来说，其代谢与能量资源主要用于蛋白质合成。因此蛋白质合成在细菌生长中处于核心环节。核糖体负责合成蛋白质。蛋白质的合成速率取决于两个重要定量指标即核糖体的含量以及单位核糖体的翻译延伸速率。核糖体含量可以通过测定RNA/protein比值得出，然而，测定细菌核糖体翻译延伸速率的传统方法具有较大局限性，因此这一重要参数在其它种类细菌中鲜有报道。在近期的工作中,我们建立了一种基于β-半乳糖苷酶阿尔法互补系统的方法来测定细菌翻译延伸速率。该方法简单快捷并且定量性较好，但其目前主要适用于大肠杆菌的相关研究。本研究旨在改进该方法，并结合绿色荧光蛋白报告系统，建立可以测定其它不同种类细菌核糖体翻译延伸速率的普适性方法。新方法将为理解不同细菌生长能力差异的内在机制提供有力的技术性支撑。

为了保证种群在逆境状态下的存活，细菌需要随时响应环境的变化来调节自身的蛋白质合成效率与全局基因表达调控网络。鉴于蛋白质合成在细菌生长过程中的核心地位，本项目主要通过分子微生物学以及微生物生理学等研究手段，建立基于 LacZ 阿尔法片段互补法以及基于绿色荧光蛋白报告法的核糖体翻译延伸速率测定方法，并对细菌的蛋白质翻译效率与生长速率的联系进行定量研究。项目成果如下：（1）成功建立了适用于多种细菌的核糖体翻译延伸速率测定方法，进而将其应用在研究细菌生长与蛋白质合成效率的偶联机制中。（2）应用该方法定量研究了核糖体翻译延伸速率与RNA聚合酶的转录延伸速率的关系。揭示了(p)ppGpp对细菌基因表达过程的关键环节——转录翻译偶联现象的调控作用，揭示了细菌维持转录翻译偶联的全新机制。此外同时发现在大肠杆菌体内，核糖体并不参与控制RNA聚合酶的移动速度，改写了核糖体“推行”RNA聚合酶这一国际主流的转录翻译偶联模型。（3）研究发现(p)ppGpp可以对决定大肠杆菌生长的两大“核心部门”——核糖体蛋白与代谢类蛋白在蛋白质组的资源分配进行全局调控，进而控制细菌的指数期生长。其实就是揭示了(p)ppGpp这种小分子在大肠杆菌体内起到了“超级管家”的地位。（4）采用该方法定量研究了两种重要逆境——氧化胁迫与高盐胁迫对细菌生长与蛋白质翻译效率的抑制机制。一方面发现维持核糖体翻译延伸过程是决定细菌能否经受氧化胁迫的关键性生理指标，另外发现高盐胁迫通过抑制tRNA与核糖体的结合进而抑制蛋白质翻译延伸过程。综上所述，该项目的系统研究成果揭示了细菌蛋白质合成与生长的偶联机制，对于未来的细菌合成生物学应用具有理论指导意义。

内容获取失败，请点击重试