植物G-蛋白效应分子的遗传筛选与作用机理研究

Heterotrimeric G-proteins composed of α, β and γ subunits are responsible for transmitting extracellular signals sensed by receptors into cytosolic effectors. In plants, G-proteins have been demonstrated to play important roles in growth, development and responses to various stresses. In the past years, significant advance was made with regard to identification of receptors and mechanisms of G-protein activation. However, how G-proteins tranduce signals to downstream effectors remains largely unknown. Our previous study found that inducible expression of a constitutively active form of the G-protein alpha subunit (Gα*) leads to stagnation of seedling growth, which provides us a promising starting point to investigate effectors of Gα. We therefore established EMS-mutagenized stocks and screened for mutants (suppressors of G-protein alpha, soga) that suppress the stagnation phenotype induced by expression of Gα*. In this proposal, we plan to isolate a batch of soga mutants and to clone genes from soga mutants. Then, we will identify G-protein effectors and elucidate mechanisms by which effectors mediate G-protein signal transduction. Our data will provide new insights into mechanisms of G-protein signaling as well as new ideas to improve crop yields and resistance to stresses.

由α、β和γ三个亚基组成的G-蛋白既专一又精确地将受体感知的胞外信号传递给胞内的下游效应分子。大量的研究结果表明G-蛋白参与植物生长、发育以及逆境胁迫等各种生理生化过程。近年来，在鉴定G-蛋白受体及其调控G-蛋白信号转导的机理研究中取得了突破性进展，但关于G-蛋白效应分子的认识非常有限。我们前期的研究结果发现：诱导表达组成型激活态Gα亚基（Gα*）导致幼苗生长停滞，这为我们解析Gα效应分子提供了很好的切入点。为此，我们构建了突变体库，通过高通量遗传筛选获得了能恢复诱导表达Gα*导致生长停滞表型的突变体（soga）。本项目拟在筛选soga突变体的基础上，分离一批soga基因，通过分子生物学、遗传学和生物化学等手段从中鉴定G-蛋白效应分子，阐明其传递G-蛋白信号的分子机理。相关研究结果将完善我们对G-蛋白信号转导机制的认识，也为将来运用生物技术改良作物品质和抗性奠定理论基础。

由α、β、γ三个亚基组成的异三聚体G蛋白是在真核细胞中保守的信号转导分子，通常与7次跨膜的G蛋白偶联受体一起将胞外信号传递到胞内。拟南芥仅有一个经典的α亚基（GPA1），一个β亚基（AGB1）和三个γ亚基（AGG1-3）。现有的研究结果表明G蛋白信号通路参与植物生长发育与抗逆等诸多的重要过程，但G蛋白的作用机制尚不清楚。在本研究中，我们发现除gpa1和gpa1 agb1外，G蛋白功能缺失突变体agb1和rgs1和野生型一样在3%葡萄糖培养基上的侧根（LRE）密度比1%葡萄糖下显著增加，说明由中低葡萄糖浓度诱导的侧根发育依赖于GPA1。然后，我们运用酵母双杂交体系筛选GPA1互作蛋白，并通过体内外验证，发现GPA1与阿罗酸脱水酶（ADT）在质膜上直接互作。拟南芥一共有6个ADTs，除ADT2外其他5个ADTs均能通过QAVEL基序与GPA1互作，但亲和力随GPA1的不同状态而有所差异。有趣的是ADT4和ADT5在WT中过表达导致转基因植株生长严重抑制，但在gpa1中过表达没有明显的生长缺陷。进一步分析表明GPA1突变导致ADT4的蛋白积累水平剧烈下降，但不影响转基因的mRNA水平，说明GPA1具有增加ADT4蛋白稳定性的作用。与ADT4相似，ADT3蛋白水平在gpa1中也明显下降。蛋白酶体抑制剂MG132处理能明显提高ADT3和ADT4在gpa1背景下的蛋白水平，说明ADT3和ADT4通过26S蛋白酶体降解。为了阐明GPA1与ADTs互作是否也影响他们的催化活性，我们纯化了重组蛋白并分析了不同活性状态的GPA1对ADT3的预苯酸脱水酶（PDT）活性的影响，结果表明ADT3具有PDT的活性，而GDP结合状态的GPA1与ADT3的互作能增强其PDT的活性，暗示催化产物苯丙酮酸（PPA）有可能进入苯乙酸（PAA）的合成途径。遗传学实验证据显示GPA1和ADT3位于同一遗传途径参与葡萄糖调控LRE密度。另外，gpa1和adt3对6%葡萄糖超敏感，而PAA处理可以部分恢复gpa1和adt3对葡萄糖响应的表型，说明生长素PAA具有促进成苗的作用。综上所述，本研究结果揭示了GPA1在葡萄糖诱导的侧根发育过程中通过调控ADT3的蛋白稳定性及其PDT活性启动生长素PAA合成的分子机制，为我们认识糖为什么具有类似生长素一样的功能提供了理论依据。

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