木质纤维素高效水解多酶混合物(multi-enzyme cocktails)的高通量分析及其理性定制

木质纤维素生物炼制仍面临着一些瓶颈性问题，其中成本高昂的酶解产糖过程尤为突出，它可归因于以下三方面：不同来源（种属和预处理）基质在组成结构上存在差异性，但目前商业纤维素酶的基质针对性和适应性差；不同来源纤维素酶之间及其各组分的协同能力有限；纤维素酶必需蛋白含量偏低，导致比活力不高。于是，本课题首先全方位/多尺度地了解不同来源木质纤维素的理化组成、超微结构和关键性化学键/官能团特征；然后，针对一些特定基质的组成结构特点，从商业酶制剂或其它同/异源表达产物中挖掘与糖苷水解密切相关的纯酶组分，再结合高通量酶分析来优化设计和定向重建适用于基质高效水解的多酶混合物，并结合微观动态分析来诠释多酶混合物协同水解的作用机制；最后分别辨析不同来源基质组成结构的共性和差异以及其对应多酶混合物组成比例的共性和差异，建立其组成比例与基质来源之间数学关系，为未来不同来源木质纤维素的经济高效水解提供理论和技术支撑。

尽管关于木质纤维素的生物炼制已经成为近年来的研究热点，但真正的生物质经济时代尚未到来，由木质纤维类生物质实现生物能源和生物基产品的生物炼制技术仍旧面临着许多瓶颈问题，其中预处理和酶解问题尤为突出。.本项目开展如下内容：.1）农林纤维类生物质原料简单经济和环保高效的预处理方法；.2）纤维素酶的原位发酵和酶蛋白外源表达；.3）纤维素酶制剂复配定制；.4）纤维素乙醇浓醪发酵。.主要结果.1）预处理：甘油有机溶剂预处理（固液比1:7–20，在210–230 ℃下保温蒸煮2 –3 h）后基质纤维素保留率为90%以上，半纤维素和木质素脱除率分别为70%和60%以上，基质48 h酶解率可达90%以上，并初步阐明了该预处理机制）。蒸汽汽爆-碱性(pH11.5)过氧化氢联用分别原料中脱出80%以上半纤维素和90%木质素，从而实现原料三大组分有效分离，预处理后基质纤维素纯度达到60–70%。.2）纤维素酶制备：通过对里氏木霉Rut-C30理化诱变、培养优化、外加添加剂和分批补料等策略使菌株产酶滤纸酶活由0.5 FPU/mL增加到4.0 FPU/mL左右；目前已在毕赤酵母里成功表达出纤维素水解酶(CBHⅡ, EGⅡ)、木聚糖水解酶(EX, BX) 和辅酶AA9，酶蛋白含量在0.5–5 g/L水平。.3）通过外加添加剂或辅酶探讨纤维素酶制剂的复配定制：目前已发现一些添加剂和辅酶的积极作用，这部分工作仍在进行中。.4）纤维素乙醇浓醪发酵的探索：甘油有机溶剂预处理基质（浓度相当于35%）发酵72 h时乙醇产量达到了73 g/L，纤维素转化率为67%。以汽爆碱性过氧化氢预处理基质糖化（Cellic CTec2酶载量30 FPU/g）发酵84 h时乙醇产量将近80 g/L，纤维素乙醇转化率为70%，最近有希望在糖化发酵84 h时乙醇产量将近100 g/L，纤维素乙醇转化率为80%。.科学意义.1）在国内外率先开展常压甘油有机溶剂预处理技术工作，该技术通过使用生物柴油工业的低品级甘油副产物，有助于推动生物柴油和纤维类生物质炼制商业化的共同健康发展，也为制浆造纸、纺织和其它纤维材料加工业贡献一种新方法。.2）纤维素乙醇浓醪发酵发酵技术在基质浓度、酒精浓度和发酵效率等指标都处于国际较好水平，为纤维素乙醇工业化提供技术支持。.

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