Sca-1基因甲基化调控吸烟所致内皮祖细胞生存及自我更新障碍的机制研究

内皮祖细胞（EPC）能分化为成熟内皮细胞并直接参与肺气肿损伤肺泡间隔细胞的修复，干细胞抗原1（Sca-1）是一种抑制细胞周期和分化的糖基磷脂酰肌醇锚定细胞表面蛋白，参与调控多种干/祖细胞分化发育及自我更新。我们最新研究显示体外培养EPC表达Sca-1，且香烟提取物（CSE）刺激后Sca-1表达下降，同时COPD患者循环中存在EPC数目减少和功能障碍。但Sca-1是否参与调控EPC生存和自我更新及其可能的机制尚未见报道。本研究通过CSE、甲基化抑制剂处理EPC和吸烟COPD模型后观察Sca-1表达、甲基化水平及EPC凋亡和功能变化，并通过甲基化芯片技术和体外甲基化技术，进一步明确Sca-1基因甲基化序列，由此首次探讨Sca-1基因通过DNA甲基化调控吸烟所致EPC生存及自我更新障碍的作用及其机制，为COPD治疗探索新的途径。

既往研究证实体外培养内皮祖细胞（EPCs）表达干细胞抗原-1（Sca-1），且香烟提取物（CSE）刺激后Sca-1表达下降。本课题通过慢性阻塞性肺疾病（COPD）病人、动物模型和细胞三个层面进行研究。通过分离并培养COPD患者的EPCs，并对其进行增殖、粘附和分泌能力检测，发现COPD患者循环中存在EPC数目减少和功能障碍。既往我们通过香烟烟雾暴露法来建立COPD动物模型，但建模耗时长。故本次实验采用腹腔注射香烟提取物（CSE）的方法成功建立COPD小鼠模型。通过对COPD小鼠模型骨髓EPCs的c-Kit与c-Kit配体的检测，发现二者的相互作用是内皮细胞修复过程中的重要步骤，参与小鼠肺气肿模型的形成。通过去甲基化剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷（AZA）与CSE共同干预小鼠，发现AZA可能通过部分逆转CSE对骨髓EPCs及肺组织Sca-1表达的抑制作用，而发挥对肺功能和肺组织形态学的保护作用。在体外细胞实验中，成功分离、培养并鉴定了EPCs，发现CSE可同时降低EPCs增殖、粘附及分泌能力和Sca-1的表达。进一步研究用AZA与CSE体外干预培养EPCs，通过检测其功能及体外甲基化技术，发现短时间低浓度的CSE干预使得EPCs的增殖功能代偿性增强，延长干预时间和/或提高干预浓度都将使EPCs的功能降低，甚至完全抑制，呈时间和浓度依赖。AZA能部分逆转CSE对EPCs上Sca-1蛋白表达的抑制作用，同时改善EPCs的功能，EPCs上Sca-1蛋白表达和EPCs功能改变趋势一致，其去甲基化作用位点位于Sca-1基因启动子区。同时，进行了表观遗传学与COPD发病机制的探索，发现COPD患者线粒体转录因子（mtTFA）表达下降，mtTFA基因甲基化可能参与COPD发病机制；在AZA与CSE共同干预的小鼠模型中，去甲基化治疗同样可以使mtTFA 、细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基（COX II）表达上调，影响COX活性，从而发挥对CSE所致小鼠肺气肿模型的保护作用。本课题研究为COPD的治疗提供了新的理论基础。

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