发酵大豆制备心血管内皮不依赖性舒张功能活性小肽及机理研究

Recent trend in the treatment of cardiovascular diseases like hypertension by using functional foods instead of harmful drugs is popular among the world. The vasoactive small peptides from natural foods sources such as fermented soybeans and their products is believed to be particularly reliable, safe and with commercial potential. The fermentation and hydrolysis method of soybean and their products will be studied to generate small chain peptides fraction, followed with isolation and identification by using GPC, microfiltration membrane, HPLC (with Ni2+ chelating column), MS and amino acid sequencer. The isolated small peptides will be synthesized by Fmoc-solid phase peptide synthesis and their endothelium- dependent vasorelaxation activity will be screened and verified by investigating the Sprague-Dawley (SD) rat aorta ring in organ bath system. Preliminary research about molecular biological mechanism of the most potent endothelium-independent vasorelaxation small soy peptide will be observed and compared with our previous results. Finally, this study will return to verify hydrolysis mechanism and build a full version of isolation protocol to isolate this peptide from soybean, industrial byproducts and even the genetically modified soybeans. This study will provide a theoretical basis and technical support for the fermented soybean functional food research, and it is expected to avoid the potential risk of unexpected contamination of genetically modified soybeans.

开发功能食品辅助药物治疗高血压等心血管疾病成为世界学术界关注热点。从纯天然食物如发酵大豆及其制品中提取血管活性功能小肽不但可摒除人工合成肽类的食用毒性风险，还具有强大的商业化生产潜力。本课题研究大豆及其制品的发酵、水解方法，利用碱性外切酶将大豆蛋白直接分解成富含特殊端链的小分子肽，运用GPC、超滤膜、配有固定金属亲和层析柱（Ni2+螯合柱）的HPLC，以及质谱和氨基酸序列仪等现代分离定性手段检定提取小肽，随后用固相肽合成法制备各小肽，并研究其大鼠主动脉心血管内皮不依赖型血管舒张活性，筛选锁定最强活性功能小肽，初步探索其分子生物学机制。本课题最后将返回验证水解机理并构建发酵水解分离全套制备目标小肽的技术路线。本研究的开展将为大豆发酵制品甚至是转基因大豆加工副产物豆粕的利用提供理论基础和技术支持，预期可规避其制品污染风险。

天然蛋白质水解产物小肽诱导的多种离体血管活性及体外血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性研究是一种替代药物的食品科学研究方向，其中大豆蛋白提取生物活性小肽的研究最为活跃。本项目经三年研究开发了利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）及其混菌发酵大豆豆粕并结合多级超滤、纳滤配合凝胶渗透色谱(GFC)和高效液相色谱(HPLC)分离纯化具有大鼠主动脉心血管舒张活性和ACE抑制活性的小肽的方法。利用氨基酸序列分析仪（PPSQ-21）和基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱基质 (MALDI-TOF-TOF/MS)定性，再用标准固相肽合成法（SPPS）合成小肽，对小肽和水提物纳滤组分进行SD大鼠的心血管离体实验，并用HPLC法测定它们的ACE 抑制活性。结果表明，超滤纳滤后得到不同分子量滤液组分均具有不同程度的血管舒张和ACE 抑制活性，且分子量最小的组分活性最强。从分子量最小的组分中分离纯化的一些小肽具有内皮不依赖型血管舒张和ACE 抑制活性，在相同浓度下其舒张活性和抑制率高于分子量最小的组分。离体实验的结论则进一步证实，尽管大豆提取小肽也具有类似的浓度依存血管舒张趋势，但其活性强度与ACE抑制活性不直接相关，例如PANV和GPANV有完全不同的血管活性和ACE抑制活性，而同时具有较高ACE抑制活性的QC和CQ甚至表现出截然相反收缩血管和舒张血管的构—效关系。实验证明，两株活性菌及其混菌发酵豆粕配合超滤纳滤的方式可以从大豆加工副产物中制备具有血管生物活性的组分，其生物活性可能来源于这种组分中的部分小肽，该研究以期可以启发未来对降压功能食品的基础研究和开发。另外，从发酵大豆制品中寻找到了内皮不依赖舒张血管和ACE抑制的三肽HGK的存在，验证了深度发酵酶解工艺可以获得大豆蛋白血管活性小肽，同时针对内皮不依赖血管舒张小肽所涉及的血管平滑肌细胞（VSMC）开发的胞内钙离子高通量筛选检测方法为后续的课题研究奠定了基础。

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