运用单分子技术研究转录因子与核小体及DNA的相互作用

从1953年DNA双螺旋结构的提出到六十年代"中心法则"的确立，分子生物学已经经历了半个多世纪的辉煌，生命科学在此期间取得了非凡的进展。 到如今的"后基因组时代"，经典生物学的定性描述已经无法满足当代科学家的需求。 深入细致地定量研究生物学问题正不断地吸引着全世界最出色的科学家涌向生物学的各个领域。 近十多年来，单分子技术在世界范围内被广泛地运用于生物医学研究，对定量生物学的发展产生着深远的影响，使很多令人感兴趣的生物学问题实现了单分子灵敏度的研究和理解。 申请人等已经运用单分子荧光技术得到了有关人类转录因子糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor：GR）在有和没有组蛋白的DNA上具有不同特异性结合的初步数据。 在这一前提下，本项目将进一步研究转录因子如GR在含有组蛋白的DNA上的特异及非特异性结合问题，解决转录因子在核小体DNA上对于特定位点的寻找及结合问题。

近年来，单分子技术被广泛运用于生物医学研究，对定量生物学产生着深远影响，很多令人感兴趣的生物学问题实现了单分子灵敏度的研究和理解。申请人实验室在面上项目“运用单分子技术研究转录因子与核小体及DNA的相互作用”资助下，建立了一套基于单分子荧光技术与微流控制联用的高精度技术平台，该技术可以把测量蛋白质与DNA之间的解离速率常数的误差控制在20%以内。并运用这一技术分别研究了核小体DNA的结构变化对DNA-蛋白质相互作用的调控，DNA结构变化在DNA中的传递效应（别构效应）等问题。 . 首先，DNA的结构变化会直接参与DNA-蛋白质相互作用的调控，这在核小体DNA中的表现是会使蛋白质结合的稳定性随着其结合位点在核小体上的位置不同而发生增强和减弱的变化。我们用GRDBD作为研究对象，发现它对核小体的一些位置的GREs3的结合强度甚至超过了完全自由的GREs3，是对自由GREs3的1.5倍。而在GREs3完全背向组蛋白的时候（组蛋白对其的屏蔽效应最小），GRDBD对其的结合力却出现了一个突然的降低，在这个位置的平均结合时间几乎是其边上（仅仅1bp的位移）位置的四分之一。之后运用 HADDOCK研究了核小体增强效应和减弱效应最强位置的核小体DNA与GRDBD的相互作用，发现是因为组蛋白固定了DNA 的构象而影响了蛋白质与其相互作用的图谱。因此，核小体DNA-蛋白质相互作用不只单单受到是否被组蛋白屏蔽的调控，同时也受到DNA结构所处构象的调控。. 其次，DNA的结构（构象）变化会沿着DNA轴传递，产生所谓“别构效应”，两个结合在同一DNA相距二十碱基内的蛋白会因而互相影响对DNA的结合能力，其变化幅度随两个蛋白间DNA的长度增强或变弱，呈现出大约10个碱基的周期性，正好是DNA双螺旋的周期，这种效应的大小会随着蛋白间的距离增加而衰减，其半衰期为15bp。进一步通过各种对照实验及分子动力学模拟计算，确认了这种效应不是由诸如蛋白－蛋白相互作用、静电相互作用等因素造成的，而是由蛋白质结合到DNA上导致的DNA双螺旋构象变化引起的。而这种构象变化主要体现在大沟的距离变化上，假设蛋白A和蛋白B结合到DNA上后都会撑大大沟，那么蛋白A在DNA上的结合将导致其结合位点周围的DNA大沟出现周期性的变宽和变窄，如果蛋白B的结合位点处在大沟变宽的位置，则结合会被增强

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