单个微气泡声致穿孔效应增强细胞膜渗透性研究

高能超声与细胞相互作用后，会在细胞膜上形成可修复的暂时性损伤，从而使得细胞外的物质（药物、基因等）进入到细胞内（声致穿孔效应）。在超声波作用下的微气泡与细胞相互作用的复杂性、操控单个微气泡方法以及实时监测此过程动态变化技术手段的缺乏，使得研究声致穿孔效应的过程及机制变的非常困难。本研究将激光技术、超声技术、高速影像技术以及电生理技术结合起来，实现定量、可控的单一微气泡与单个细胞的相互作用，同时实现对微气泡及细胞动态变化的实时监测。研究内容包括：微米尺度的单一微气泡的非接触式三维操控；实现真正意义上的定量、可控的单一微气泡与单个细胞相互作用；微气泡及细胞相互作用的动态物理过程；实时监测细胞膜的渗透性动态变化过程；声致穿孔效应增强细胞膜渗透性的最佳物理参数。本项目研究微气泡在超声作用下增强细胞膜渗透性的作用机制，为研究药物、基因等在细胞水平的非损伤性、靶向性传输方法提供理论及实验基础。

超声技术已经被证明能够暂时性的增强细胞膜的渗透性。在超声对比度增强剂如微气泡的辅助下，超声能量在细胞膜上通过机械作用在细胞膜上造成一定的损伤或者穿孔，从而提高细胞质膜的渗透率，使得原来不可能渗透过细胞膜的治疗物质，如：治疗药物、基因、蛋白质及其它生物大分子等通过细胞膜上的穿孔运输至细胞内,这一过程被称为声致穿孔效应。 .由于没有合适的控制及实时监测技术，细胞水平上的单一微气泡的声致穿孔效应对细胞膜的渗透率暂时性增强机制还不是很清楚。传统研究声致穿孔效应的方法有以下3个缺点：1、不能实现真正意义上的可控的单一气泡与细胞相互作用；2，不能实时地对声致穿孔效应的动态过程进行观察；3、无法实时测量细胞对声致穿孔效应的反应。 .本研究的研究内容主要包含2个方面：1、微米尺度的单一微气泡的非接触式三维操控； 2、可控的单一微气泡的声致穿孔效应对细胞膜的渗透率暂时性增强机制。 .在本课题中使用高速光学摄像技术及高频超声成像技术，研究了高能飞秒脉冲激光在水中自聚焦发生光学诱导击穿、产生并捕获微气泡的动态过程。还应用超声技术定量研究了飞秒脉冲激光束对捕获的微气泡的横向束缚力。通过光学技术与超声技术的结合实现了微米尺度的单一微气泡的非接触式三维操控。 .用能量较低的超声波将被捕获在光束内的微气泡放置到靶向细胞附近指定的位置（控制精度达到微米量级）。在高能超声的作用下，微气泡剧烈收缩、膨胀最终崩灭，与细胞发生相互作用在细胞膜上产生穿孔从而使细胞膜的渗透性增强。采用了四种独立的实时监测手段对这一过程进行了监测：1）M-mode 超声成像；2）B-mode超声成像；3）高速光学摄像技术；4）电压钳技术。研究了各种物理参数对声致穿孔效应的影响，包括：1）超声能量；2）脉冲重复频率 PRF (Pulse repetition frequency); 3)超声脉冲数量；4）微气泡与细胞壁的间距等。 .通过本课题的研究，取得的主要成果如下：1）阐述了自聚焦飞秒脉冲激光在水中产生并捕获微气泡的动态过程；2）应用飞秒脉冲激光及超声技术，首次实现了微气泡非接触式三维操控，弥补了传统光镊技术的不足；3）分析在单一细胞水平上，声致穿孔效应与空穴效应之间的联系；4）定量分析微气泡通过声孔作用于细胞膜发生作用的有效距离；5）确定了声致穿孔效应的动态过程并确定其最优化参数。

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