蓝光照射致人RPE细胞凋亡的机理及对其功能的影响

视网膜色素上皮（RPE）细胞能吸收外来光，转运营养成分和离子，排除光感受器的代谢产物，并具有分泌功能，有助于维持光感受器结构完整和预防光损伤，是维持视网膜正常功能的重要细胞。近期的研究表明，在各种遗传性视网膜色素变性和光致视网膜损伤病变中，细胞凋亡是光感受器和RPE细胞丢失的主要机制。我们前期的工作发现，蓝光照射RPE细胞后，出现典型细胞凋亡形态变化，线粒体肿胀，内膜嵴消失，光照早期出现线粒体膜电位降低，细胞色素C释放。这是一些很有意义的实验结果。本项目拟在上述工作基础上，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞、Western blots和ELISA等技术，进一步确证蓝光照射是否是通过线粒体途径诱导RPE细胞凋亡？Ca2+-PKC信号通路是否参与这一凋亡事件，以及蓝光照射对RPE细胞分泌功能的影响，这些研究对认识光损伤对RPE细胞结构与功能的改变有重要意义，进而对视网膜变性类疾病的预防有重要价值。

目的：探讨蓝光照射致人视网膜色素上皮( retinal pigment epithelium， RPE)细胞凋亡的机制，以及RPE细胞分泌血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）变化，光照致RPE细胞三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3）和二酰甘油( diacylglycerol, DAG)的浓度变化。.方法：根据不同目的，设置不同分组方法，（1）采用20W，波长450～500nm医用蓝光灯作为光源，建立体外培养人RPE细胞（retinal pigment epithelium, RPE）凋亡模型方法，采用倒置显微镜、TUNEL法检测细胞凋亡，计算凋亡指数（apoptotic index, AI）；流式细胞术检测细胞凋亡百分比。（2）采用Western -blots法检测RPE细胞内Bax、Bcl-2、Bcl-xL、caspase-9蛋白表达量的变化。（3）采用Flou-3 AM Ca2+荧光探针标记各组RPE细胞，激光扫描共焦显微镜（LSCM）测定各组细胞内Ca2+荧光强度，非放射性核素法测定RPE细胞蛋白激酶 C (PKC)活性。（4）采用酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbentasssy,ELISA）测定各组RPE细胞内三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3）和二酰甘油( diacylglycerol, DAG)的浓度，各组细胞分泌VEGF、PEDF浓度。.结果：（1）光照强度2000±500Lux，光照6h，终止培养24h为建立蓝光照射致人RPE细胞凋亡的最适合条件。在此条件下出现典型RPE细胞凋亡的形态学变化，细胞的体积缩小变圆，胞核浓缩，边聚成新月形或帽状；凋亡指数及RPE细胞凋亡百分比最高。（2）：与无光照组比较，蓝光光照组的Bax及Caspase-9蛋白表达增加（t=-4.409，-4.168；P=0.012，0.014）；Bcl-2及Bcl-xl蛋白表达减少（t=7.575，6.068；P=0.002，0.004）。（3）与无光照组比较，光照组RPE细胞内钙离子荧光强度升高（P=0.000）；PKC

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