miRNAs对肺泡巨噬细胞自噬溶酶体成熟及抗结核分枝杆菌感染的调控机制

microRNAs(miRNAs), well-known gene regulators, regulate the autophagy process by regulating the transcription of autophagy genes. The survival of Mycobacterium tuberculosis (MTB) in the host cells is related with the mature of autophagy lysosome. And the regulatory mechanism of miRNAs on the macrophage autophagy is still unclear. In this study, we firstly establish the model of autophagy and autophagy lysosome mature of RAW264.7 cells after treated with rapamycin and 3-MA. Then we infected the cell model with MTB, and screen the specific miRNAs and mRNAs involved in the regulatory process of autophagy and autophagy lysosome mature by the method of miRNA co-immunoprecipitation. Next, we verify the relationship of miRNAs and the key molecules (Atg1, Beclin1, ATG8, mTOR et al.) by the dual-luciferase reporter system, making the regulatory network between the miRNAs and the autophagy genes. Further, we construct the miRNA over-expressed and lost-expressed lentiviral vectors and establish the relative MTB-effected autophagy model of RAW264.7 cells. At last, we use the methods of transmission electron microscope, Western blot, Real-Time PCR and laser scanning confocal microscope to reveal the regulatory mechanism of miRNAs on the effect of the macrophage autophagy and the inhibition effect of Mycobacterium tuberculosis on autophagy lysosomal mature.

微小RNA是已被广泛认可的基因调控子，通过调控细胞自噬基因的转录，参与调控自噬过程。结核分枝杆菌（MTB）在宿主细胞内的存活与自噬溶酶体的成熟有着密切的关系，miRNAs对巨噬细胞自噬的调控机制，尚不明晰。本研究拟用雷帕霉素与3-MA处理RAW264.7细胞，建立自噬与抑制自噬细胞模型，基于miRNA免疫共沉淀方法，筛选感染MTB后，参与调控自噬与自噬溶酶体成熟的特异性miRNAs与mRNAs，利用双荧光素酶报告系统，验证miRNAs与Atg1、Beclin1、ATG8和mTOR等自噬基因的靶向调控，绘制出miRNAs与自噬基因之间的调控网络；构建miRNA过表达与抑制表达的慢病毒载体，建立相应的MTB感染RAW264.7细胞自噬模型，利用透射电镜、Western blot、Real-Time PCR和激光共聚焦技术，揭示miRNAs对巨噬细胞自噬及MTB抑制自噬溶酶体成熟的调控机制。

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）是引起人畜共患疾病结核病的病原体。结核分枝杆菌可以长期存活于宿主巨噬细胞内从而造成潜伏感染。细胞自噬是机体固有免疫对抗病原体入侵和维持内环境稳态的重要防御机制。大量研究表明结核分枝杆菌感染可以引起微小RNA（microRNAs，miRNAs）差异表达，进而对细胞自噬产生调控作用。因此探究miRNA对肺泡巨噬细胞自噬溶酶体形成及成熟对揭示结核分枝杆菌的潜伏感染机制具有重要意义。在本研究中，我们通过高通量测序联合生物信息学分析，发现miR-20a、miR-144-3p、miR-17-5p、miR-142-3p、miR-129-3p、和miR-1958为可能参与细胞自噬调控的miRNA。利用RT-qPCR检测发现上述miRNA在结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型中都存在差异表达。通过miRNA靶基因预测软件、通过双荧光素酶报告实验、Western blot、RT-qPCR、激光共聚焦、透射电镜、菌落形成实验等技术发现miR-20a可以靶向结合自噬关键基因ATG16L1和ATG7的3’非翻译区（3’UTR），从而抑制ATG16L1和ATG7的蛋白表达水平，进而抑制细胞自噬小体的生成，以此促进胞内寄生结核分枝杆菌的存活；miR-144-3p通过靶向结合ATG4a在转录后水平负向调控其表达，进而抑制自噬体和溶酶体的成熟过程，以此促进胞内寄生结核分枝杆菌的存活量；miR-17-5p通过靶向抑制ULK1表达，抑制巨噬细胞自噬水平，从而促进结核分枝杆菌的感染；miR-142-3p可以抑制调控ATG4c和ATG16L1的蛋白表达量，进一步抑制细胞自噬，从而促进结核分枝杆菌的胞内存活；miR-129-3p可以靶向抑制Atg4b进而抑制自噬小体的生成，进而促进胞内寄生结核分枝杆菌的存活；miR-1958可以负向调控Atg5的表达从而抑制细胞自噬溶酶体的成熟阶段，以此促进胞内寄生结核分枝杆菌的存活。综合上述研究发现，为进一步建立miRNA细胞自噬调控网络和细胞自噬关键基因相互作用打下基础，也为更加深入探究miRNA在结核分枝杆菌潜伏感染机制中所扮演的作用提供了新的思路。

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