基于新型人干细胞滋养层分化模型及CRISPR/Cas9技术研究FOXD3经RND3-HIF1α途径调控EVT早期分化在子痫前期发病中的作用及分子机制

Preeclampsia (PE) is the main predisposing factor leading to maternal and fetal death in pregnancy. Dysfunction of early extravillous cytotrophoblast (EVT) differentiation may be the underlying cause, but its regulatory network has not been fully elucidated. 1) In our preliminary study, we found that FOXD3 is highly expressed in PE placenta. By using newly established hESC-trophoblast differentiation model and CRISPR/Cas9 technology we revealed knockout of FOXD3 promotes EVT differentiation with up-regulated RND3 expression. 2) In our previous studies, we have illustrated the molecular mechanism how RND3 modulated the HIFlαpathway, which is also known as an EVT differentiation regulator. Meanwhile, we have been authorized to use the first isolated human hTSCs. Based on above, here we plan to combine the new hESC/hTSC models with the previous animal model to explore the regulatory pathway and molecular mechanism in EVT differentiation disorder, where FOXD3 bind and inhibit RND3 to reduce HIF1α protein stability. Also, we attempt to repair the abnormal FOXD3 gene for restoring the EVT phenotype in a constructed PE-specific induced pluripotent stem (iPS) model. It is believed that our study will evidence new research models, and provide new insights for further study, clinical PE prevention and treatment.

子痫前期（PE）是导致母儿死亡的重要原因。早期绒毛外滋养细胞(EVT)分化障碍可能是根本起因，但该调控机制尚未阐明。本课题组1）前期实验，发现PE胎盘组织FOXD3高表达，利用新建的人胚胎干细胞（hESC）滋养层分化模型及CRISPR/Cas9技术敲除FOXD3提示促进EVT分化且RND3表达上调；2）既往研究，已揭示RND3调控HIF1α通路的分子机制，而后者是已知的调控EVT分化的重要因子。同时，本课题组已获赠近期首次分离的人滋养干细胞株（hTSC）。以此为基础，本项目拟结合新型的hESC/hTSC模型以及前期构建的小鼠动物模型，探讨FOXD3结合抑制RND3表达，降低HIF1α蛋白稳定而导致EVT分化障碍引起PE的调控途径和分子机制。并在已构建的PE特异性诱导多能干细胞模型中针对FOXD3基因尝试表型修复。期望为PE引入新的研究模型并提供理论依据，也为进一步临床防治提供新思路。

项目背景：子痫前期是孕产妇死亡的第二大原因，当前共识认为胎盘滋养细胞早期异常发育跟子痫前期发病密切相关。但是由于缺乏胎盘早期发育的体外研究模型，所以该领域进展缓慢。.主要研究内容：本项目开展过程中，我们检测了子痫前期及正常胎盘组织中 RND3和 FOXD3的表达。在人胚胎干细胞中用 CRISPR/Cas9敲除了 FOXD3进行滋养系分化。同时，鉴于人胚胎干细胞分化的争议，我们在体外将人胚胎干细胞和诱导多能干细胞通过小分子诱导人滋养干细胞。.重要结果及关键数据：子痫前期患者胎盘的 FOXD3表达上调，RND3表达下调。基于 CRISPR/Cas9技术体系构建了hESC的FOXD3敲除株。我们发现敲除FOXD3后 hESC 自发分化，其中包含了滋养系细胞，通过 qPCR 和 RNA 测序结果证实了滋养系特异性的基因表达，而且揭示了 BMP，Wnt, EGF 信号通路被激活。进一步地，我们发现敲除FOXD3后hESC自发分化谱系中包括中内胚层。对hESC进行FOXD3的过表达后观察到其呈现出特异性的浓度依赖性，即高FOXD3的hESC呈现出中内胚层分化，而FOXD3低强度过表达的hESC仍可维持在多能性状态。我们在 hESC 中分别敲除了TEAD4，GATA3和 CDX2三个滋养层特异性的关键因子，结果发现该三因子在人 ESC 中的作用机制不同于小鼠 ESC。TEAD4是其中最为关键的调控因子，而 CDX2在人 ESC 转变成 TSC 过程并非像在小鼠TSC 中一样重要。GATA3则可以通过两条通路来影响 hESC-滋养细胞的调控。我们建立了从人 ESC 和 iPSC 诱导出人 iTSC 的体系。通过加入小分子化合物的方法，我们直接从人hESC/iPSC 诱导出人 iTSC，然后证实了其可以分化获得下游的不同亚型滋养细胞。接着，我们利用人子痫前期(PE) 疾病来源的 iPSC 建立了疾病特异性的 iTSC，并进行了下游的分化，发现 PE-iPSC 来源的 hiTSC 分化成 EVT 存在着明显的障碍。.科学意义：本研究结果确认了 FOXD3跟子痫前期的相关性。同时，我们证明了关键因子 TEAD4，GATA3和 CDX2在人滋养细胞调控网络中的作用。重要的是，我们建立了诱导出体外人滋养干细胞的模型，为将来子痫前期等胎盘类疾病研究提供了坚实的基础。

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