高活性CaMKIIδ在人源iPS分化的心肌细胞中的蛋白质组及分子功能研究

Heart failure (HF) affects over 4.5 million people in China and over 23 million worldwide. HF is associated with high morbidity and mortality. Like other multifactorial conditions, progression of heart failure is modified by the genetic diversity of affected individuals. Strikingly, the Ca2+ and calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) pathway plays a core role for promoting heart failure. (1) CaMKII activity is elevated from animal models and patients; (2) CaMKII overexpression causes HF and (3) CaMKII inhibition (by drugs, inhibitory peptides and gene deletions) improves HF. CaMKIIδ is the major cardiac isoform and can be activated by phosphorylation at an autophosphorylation site (Thr287). A substitution of Threonine (Thr287) to Aspartic acid (Asp287) leads to an activated form of CaMKIIδ. Constitutively active CAMK2DT287D cardiomyocytes might recapitulate the phenotype of cardiomyopathy and heart failure. In preliminary experiments, we have introduced the T287D mutation in the endogenous CaMKIIδ in human induced pluripotent stem cell lines (iPSCs), and generated iPSC-derived cardiomyocytes. Those mutants displayed similar clinical features in patients with heart failure, including enlarged cells and massive cell apoptosis/death; transcriptome analysis revealed significantly enriched gene expression changes in heart/muscle related pathways, suggesting a promising disease model for studying cardiomyopathy and heart failure. However, how active CaMKIIδ initiates dramatic downstream changes is unclear. To this end, we propose to perform proteomics and phosphoproteomics assays, integrate multi-omic data, build spatiotemporal regulation network of active CaMKIIδ, understand its role in HF pathogenesis and provide new targets for future preventions/treatments.

心力衰竭的发病和死亡率目前均较高，严重威胁患者生命安全及生活质量。近年研究发现钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKII）在心衰发生和发展过程中起关键作用，其活性在病人中显著增强，是研究心衰病因及防治措施的潜在重要靶点，但其在人类心脏中功能尚不清楚。因此，我们利用基因组编辑技术在人诱导性多能干细胞中引入突变，改变其最重要的自磷酸化位点；接着诱导其分化为心肌细胞，研究该激酶活性激活对细胞形态、基因/蛋白表达的影响。目前，我们已在突变体中发现细胞肥大、凋亡等多项心衰特征；转录组分析显示心脏和肌肉相关通路上的基因表达变化。这些结果提示该突变心肌细胞是研究心衰的理想模型，但该激酶直接作用靶基因及调控网络仍不清楚。因此，我们还将利用蛋白质组方法，检测蛋白质丰度、细胞定位及磷酸化变化，整合转录组数据，构建分子时空调控网络，识别关键节点基因，阐明其在心衰发生发展过程中的分子机制，为心衰防治提供新靶点。

心力衰竭的发病和死亡率目前均较高，严重威胁患者生命安全及生活质量。近年研究发现钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKII）在心衰发生和发展过程中起关键作用，其活性在病人中显著增强，是研究心衰病因及防治措施的潜在重要靶点，但其在人类心脏中功能尚不清楚。为了识别关键节点基因，阐明其在心衰发生发展过程中的分子机制，我们利用基因组编辑技术在人诱导性多能干细胞中引入突变，改变其最重要的自磷酸化位点；接着诱导其分化为心肌细胞，研究该激酶活性激活对细胞形态、基因/蛋白表达的影响。本研究主要完成了以下工作：（1）利用蛋白质组方法，检测蛋白质丰度 、细胞定位及磷酸化变化，整合转录组数据，构建分子空间调控网络；（2）利用该疾病模型识别了一种瓣膜性心脏病相关的分子标志物：可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（suPAR），相比于N端脑钠肽前体（NT-proBNP）和高敏C反应蛋白（hsCRP），suPAR在瓣膜性心脏病患者中的特异性和敏感性均有所提高，可以开发成为一种临床诊断产品；（3）利用磷酸化组数据识别了数个CaMKIIδ特异的底物及磷酸化位点；我们发现神经肽Y的C端肽段（the C-terminal flanking peptide of neuropeptide Y, CPON）对于心肌细胞具有保护作用，能够显著降低常氧及缺氧培养时的心肌细胞凋亡比例、缺氧培养+双氧水处理时心肌细胞的凋亡比例，鉴于该发现，我们发明了一种新型的针对hiPSC-CM的冻存方法，该方法可以使复苏后的心肌细胞的凋亡比例下降39%，具有较大的应用价值；（4）对CaMKIIδ上游的血管紧张素II信号通路进行了研究，首次在hiPSC-CM中构建了血管紧张素II诱导的细胞凋亡模型，并利用该模型鉴定出MYOG基因具有拮抗血管紧张素II诱导的细胞凋亡的功能。本项目从CaMKIIδ疾病模型入手，既研究了CaMKIIδ致病机理，还利用该模型识别了一系列的标志物，其中suPAR和CPON具有很好的产业化前景，可以继续开发成为落地的产品。

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